Детектирование взаимодействия белка CD40 с умбеллифероном с помощью дифференциальной сканирующей флуоресценции

Summary

Этот протокол описывает уникальный метод обнаружения связи между соединениями и молекулами белка, обеспечивающий преимущества минимальной потери образца белка и высокой точности данных.

Abstract

Исследование взаимодействий между различными молекулами является важнейшим аспектом понимания патогенеза заболевания и скрининга мишеней для лекарств. Умбеллиферон, активный ингредиент тибетской медицины Vicatia thibetica, проявляет иммуномодулирующее действие с неизвестным механизмом. Белок CD40 является ключевой мишенью в иммунном ответе. Таким образом, в данном исследовании используется принцип технологии дифференциальной сканирующей флуоресценции для анализа взаимодействий между белком CD40 и умбеллифероном с использованием флуоресцентных ферментных маркеров. Первоначально экспериментально была проверена стабильность белка флуоресцентного оранжевого красителя, и определен оптимальный коэффициент разбавления 1:500. Впоследствии было замечено, что значение температуры плавления (Tm) белка CD40 имеет тенденцию к снижению с увеличением концентрации. Интересно, что взаимодействие между белком CD40 и умбеллифероном повышает термическую стабильность белка CD40. Это исследование представляет собой первую попытку обнаружить связывающий потенциал низкомолекулярных соединений и белков с помощью флуоресцентных микропланшетов и флуоресцентных красителей. Метод характеризуется высокой чувствительностью и точностью, обещая достижения в области стабильности белка, структуры белка и белок-лигандных взаимодействий, что облегчает дальнейшие исследования и разведку.

Introduction

Vicatia thibetica H. Boissieu, растение из семейства зонтичных, широко используется в тибетской медицине и представляет собой один из основных компонентов пяти основных ингредиентов (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., и Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. В основном распространен на юго-западе Китая, таких как северо-запад Юньнани, западная Сычуань, Тибет и другие районы, его высушенный корень служит местным заменителем дягиля¹. Корень, известный своим ароматом, ч....

Protocol

Раствор соединения, раствор белка и краситель вводили в раствор PBS. Впоследствии образцы подвергали постепенному нагреву с помощью цифровой нагревательной сухой ванны, а термическую стабильность белков оценивали путем измерения изменения интенсивности флуоресценции в сложной систе?.......

Discussion

DSF, также известный как анализ теплового сдвига или термический флуоресцентный анализ, представляет собой метод, используемый для обнаружения процесса термической денатурации белков в образцах путем мониторинга изменений сигнала флуоресценции испытуемого образца или красителя во в?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854