نعرب عن خالص تقديرنا للدعم المالي الذي تلقيناه من مشروع بناء الدلالة للخطة الخمسية الرابعة عشرة لجامعة الطب التبتي (2022ZYYGH12) ، والموضوعات المفتوحة لعام 2022 للمختبر الرئيسي للطب التبتي والتعليم الأساسي التابع لوزارة التعليم في جامعة الطب التبتي (ZYYJC-22-04) ، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي في نينغشيا (2023BEG02012) ، ومشروع تعزيز أبحاث Xinglin Scholar التابع لجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (XKTD2022013).

تم إدخال المحلول المركب ومحلول البروتين والصبغة في محلول PBS. بعد ذلك ، خضعت العينات للتسخين التدريجي باستخدام حمام جاف يهز التدفئة الرقمية ، وتم تقييم الاستقرار الحراري للبروتينات عن طريق قياس التغير في شدة التألق داخل النظام المعقد. الخطوات التفصيلية موضحة أدناه ، ويوضح الشك?...

كشف عالي الحساسية لارتباط البروتين المركب باستخدام التألق

<ol>
	<li>Cairang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+standardization+of+clinical+application+of+Tibetan+medicine+&amp;#34;five+roots&amp;#34.">Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine &amp;#34;five roots&amp;#34.</a> Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136 (2022).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Xigui+extract+on+immunosuppressive+mice+induced+by+cyclophosphamide.">Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide.</a> Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Vicatia+thibertica+de+boiss+on+immunologic+and+hematopoietic+function+of+mice.">Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice.</a> J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).</li><li>Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+constituents,+quality+control+and+pharmacology+research+progress+of+Xigui.">Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui.</a> Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+total+flavone+extract+from+Shuiqin+(Oenanthe+Javanica)+on+immune+function+of+immunosuppression+mice.">Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice.</a> Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).</li><li>Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+agonist+antibodies+in+cancer+immunotherapy.">CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy.</a> Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).</li><li>Grewal, I. S., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+and+CD154+in+cell-mediated+immunity.">CD40 and CD154 in cell-mediated immunity.</a> Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).</li><li>Long, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+and+CCL2+cooperate+to+redirect+tumor-infiltrating+monocytes+to+degrade+fibrosis+and+enhance+chemotherapy+efficacy+in+pancreatic+carcinoma.">IFN&#947; and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma.</a> Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+regulatory+B+cells+in+cancer.">The roles of regulatory B cells in cancer.</a> J Immunol Res. 2014, 215471 (2014).</li><li>Eliopoulos, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+induces+apoptosis+in+carcinoma+cells+through+activation+of+cytotoxic+ligands+of+the+tumor+necrosis+factor+superfamily.">CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily.</a> Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).</li><li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability.">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).</li><li>Rosa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meltdown:+A+Tool+to+help+in+the+interpretation+of+thermal+melt+curves+acquired+by+differential+scanning+fluorimetry.">Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry.</a> J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).</li><li>Hellman, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+based+assessments+of+the+thermal+and+kinetic+stability+of+peptide-MHC+complexes.">Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes.</a> J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).</li><li>Gorny, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+nano-differential+scanning+fluorimetry+and+microscale+thermophoresis+to+investigate+VDAC1+interaction+with+small+molecules.">Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules.</a> J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821 (2023).</li><li>Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+denaturation+methods+in+the+study+of+protein+folding.">Thermal denaturation methods in the study of protein folding.</a> Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).</li><li>Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical,+thermal+and+morphological+properties+of+polybutylene+succinate-waste+pineapple+leaf+fibres+composites.">Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites.</a> Heliyon. 9 (11), 21238 (2023).</li><li>Zhou, C., Yu, M., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparation+of+three+measuring+methods+for+thermodynamic+stability+of+protein.">Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein.</a> Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway.">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568 (2023).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside,+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata,+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1/p53/Drp1+signaling.">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).</li><li>Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+tool+to+study+protein+interactions+and+their+implication+in+human+diseases.">Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (14), 7672 (2022).</li><li>Kamat, V., Rafique, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+binding+kinetic+assay+on+the+bio-layer+interferometry+(BLI)+biosensor+to+characterize+antibody-antigen+interactions.">Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions.</a> Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).</li><li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atosiban+and+Rutin+exhibit+anti-mycobacterial+activity+-+An+integrated+computational+and+biophysical+insight+toward+drug+repurposing+strategy+against+Mycobacterium+tuberculosis+targeting+its+essential+enzyme+HemD.">Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD.</a> Int J Biol Macromol. 253, 127208 (2023).</li><li>Gr&#228;dler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+structural+characterization+of+the+impacts+of+MET+phosphorylation+on+tepotinib+binding.">Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105328 (2023).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+and+its+application+in+the+study+of+protein.">Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein.</a> Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).</li></ol>

DSF ، المعروف أيضا باسم مقايسة التحول الحراري أو مقايسة التألق الحراري ، هو تقنية تستخدم للكشف عن عملية تمسخ البروتينات الحرارية في العينات من خلال مراقبة التغيرات في إشارة التألق لعينة الاختبار أو الصبغة أثناء زيادة درجة الحرارة البطيئة والمبرمجة. تم إنشاء DSF في البداية بواسطة Pantoliano<sup class...

Vicatia thibetica H. Boissieu ، نبات في عائلة السرة ، يستخدم بشكل شائع في الطب التبتي ويمثل أحد المكونات الأساسية للمكونات الأساسية الخمسة (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute ، Asparagus cochinchinensis (Lour.) مير ، فيكاتيا ثيبتيكا إتش بواسيو ، أوكسيبافوس هيماليكوس إدجو ، وجيمنادينيا كونوبسي (L.) R. Br.) 1. موزعة بشكل رئيسي في جنوب غرب الصين ، مثل شمال غرب يونان ، غرب سيتشوان ، التبت ، ومناطق أخرى ، يعمل جذرها المجفف كبديل محلي لأنجليكا1. غالبا ما يستخدم الجذر ، المعروف برائحته ، كتوابل للحساء ، وتساهم الأوراق ، التي يشار إليها باسم الكرفس التبتي ، في الأطباق اللذيذة. وبالتالي ، فإن Vicatia thibetica لها أهمية ليس فقط كنبات طبي فريد ولكن أيضا كمصدر للغذاء في التبت.
تشير الأبحاث المحلية والدولية إلى أن Vicatia thibetica تمتلك خصائص تنشيط الدم و qi (الطاقة أو الطاقة) ، وهي مفيدة لتنظيم الحيض. يتم استخدامه لمعالجة أعراض عسر الطمث غير المنتظم الناجم عن الخفقان ونقص الدم ، ويظهر تأثيرات دوائية مثل تنظيم مضادات الأكسدة لمناعة الجسم2. أظهر مستخلص الكحول من Vicatia thibetica القدرة على استعادة كتلة الجسم ومؤشر الأعضاء في الفئران التي تعاني من نقص المناعة الناجم عن سيكلوفوسفاميد. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يزيد من نشاط ديسموتاز الفائق في المصل ويقلل من محتوى malondialdehyde ، مما يشير إلى تحسن في قدرة مضادات الأكسدة وتأثير متوازن على بيروكسيد الدهون 2,3. في الوقت نفسه ، فإنه يعزز عدد خلايا الدم والهيموجلوبين ، والذي لا يعكس بشكل موضوعي وظيفة المكونة للدم في الجسم فحسب ، بل يلعب أيضا دورا مهما في جهاز المناعة 2,3.
Umbelliferone ، الذي يتميز بالبلورات الدائرية والطعم المر ، يمتلك وزنا جزيئيا صغيرا ، وهو متقلب ، ويمكن تقطيره بالبخار. يتسامى بسهولة ، وله قابلية ذوبان منخفضة في الماء ، وقابلية عالية للذوبان في المواد العضوية. كأحد المكونات الكيميائية الرئيسية ل Vicatia thibetica ، يظهر umbelliferone تأثيرات مناعية على المناعة الخلوية ، والمناعة الخلطية ، والمناعة غير المحددة في نماذج الفئران المثبطة للمناعة التي يسببها الهيدروكورتيزون 4,5.
يتم التعبير عن جزيء سطح الخلية CD40 ، وهو عضو في عائلة مستقبلات عامل نخر الورم ، على نطاق واسع في الخلايا المناعية6. ليجنده المتماثل ، CD154 ، المعروف أيضا باسم CD40L ، هو بروتين عبر غشائي من النوع الثاني يتم التعبير عنه بواسطة الخلايا الليمفاوية التائية المنشطة. تنشيط CD40 لديه القدرة على تنظيم التعبير عن جزيئات التحفيز المشترك على سطح الخلايا المتغصنة (DC) والوحيدات. تعزز هذه العملية وظيفة عرض المستضد لجزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) وتنشط خلايا CD8 + T7.
تلعب البلاعم دورا مهما في تكوين وتنظيم البيئة المكروية للورم ، ويمكن أن يعزز تنشيط CD40 إعادة تشكيل البيئة المكروية للورم بواسطة البلاعم8. يؤثر تنشيط إشارة CD40 بشكل كبير على تكاثر الخلايا البائية وتنشيطها. يمكن للخلايا البائية، عند تنشيطها بواسطة CD40، أن تعمل كخلايا فعالة لمولد الضد. أنها تقدم المستضدات ، وتوليد نشاط الخلايا التائية المستجيبة ، وبالتالي المساهمة في الآثار المضادة للورم9. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تنشيط CD40 في الخلايا السرطانية إلى موت الخلايا المبرمج ويمنع نمو الورم10. يقوم CD40 في المقام الأول بتحويل الإشارات عن طريق التحكم في نشاط كينازات بروتين التيروزين غير المستقبلة ، بما في ذلك Lyn و Fyn و Syk وغيرها. بالإضافة إلى ذلك ، لديه القدرة على تحفيز بروتينات Bcl-xL و Cdk4 و Cdk6 ، وتنشيط عوامل النسخ Rel / NF-kB ، وفسفرة CG-2 و PI3K10.
تستخدم طريقة مضان المسح التفاضلي (DSF) على نطاق واسع لتقييم تأثير الظروف البيئية المختلفة ، مثل تكوين المخزن المؤقت ودرجة الحرارة وروابط الجزيئات الصغيرة ، على الاستقرار الحراري لهياكل البروتين. الصبغة شائعة الاستخدام ل DSF هي صبغة برتقالية حساسة للبيئة وكارهة للماء. في ظل الظروف العادية ، يتم طي بنية البروتين ، وإخفاء الجزء الكارهة للماء داخليا. مع ارتفاع درجة الحرارة ، تصبح المنطقة الكارهة للماء في البروتين أكثر تعرضا ، مما يؤدي إلى انهيار تدريجي لبنية البروتين الطبيعي. ترتبط الصبغة بشكل انتقائي بهذا الجزء المكشوف من البروتين ، مما يؤدي إلى تضخيم مضانها. ثم يتم حساب قيم Tm من خلال مراقبة التغيرات في اكتشاف إشارة التألق11. إلى حد ما ، يمكن للاختلافات في قيم Tm قياس التحولات في استقرار البروتين بسبب الطفرات أو التغيرات في المخازن المؤقتة أو ربط الرباط. علاوة على ذلك ، يمكن أن يشير إلى تغييرات هيكلية أثناء عملية طي البروتين12. يقدم هذا النهج بيانات دقيقة ، ونطاق واسع لدرجة الحرارة ، وحساسية عالية ، والحد الأدنى من فقدان عينة البروتين13.
في هذه الدراسة ، تم إجراء تحديد التألق باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية بدلا من جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري (PCR). يتيح هذا التعديل اكتشاف DSF في المختبرات التي تفتقر إلى أداة PCR الكمية الفلورية ، مما يجعل الطريقة أقل تعقيدا ويقلل من الخطوات المطلوبة لإعداد الجهاز ، وبالتالي تبسيط العملية التجريبية. ومع ذلك ، هناك بعض العيوب لهذا النهج. بينما يتم تقليل التعقيد ، يصبح الإجراء أكثر تعقيدا. يعد الكشف اليدوي عن التألق في درجات حرارة مختلفة أمرا ضروريا ، ولا يمكن تحقيق التجميع التلقائي والمستمر للتألق من النظام. وهكذا ، استخدمت هذه الدراسة تقنية DSF لاستكشاف التفاعل بين بروتين CD40 وأومبيليفيرون ، مما يوفر رؤى جديدة حول الآليات الجزيئية للطب التبتي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD40 protein</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-P75408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexStation 3 multifunctional microplate reader</td>
			<td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td>
			<td>FlexStation 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>v8.0724(B724)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8120485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro 7.1</td>
			<td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td>
			<td>SoftMax Pro 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSYPRO orange dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbelliferone</td>
			<td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co.</td>
			<td>B21854</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cd40 protein-umbelliferone interaction via differential scanning fluorescence

يعد التحقيق في التفاعلات بين الجزيئات المختلفة جانبا حاسما لفهم التسبب في المرض وفحص أهداف الأدوية. Umbelliferone ، وهو عنصر نشط في الطب التبتي Vicatia thibetica ، يظهر تأثير مناعي مع آلية غير معروفة. بروتين CD40 هو هدف رئيسي في الاستجابة المناعية. لذلك ، تستخدم هذه الدراسة مبدأ تقنية مضان المسح التفاضلي لتحليل التفاعلات بين بروتين CD40 و umbelliferone باستخدام علامات الإنزيم الفلوريسنت. في البداية ، تم التحقق تجريبيا من استقرار صبغة البروتين البرتقالية الفلورية ، وتم تحديد نسبة التخفيف المثلى البالغة 1: 500. في وقت لاحق ، لوحظ أن قيمة ذوبان درجة الحرارة (Tm) لبروتين CD40 تميل إلى الانخفاض مع زيادة التركيز. ومن المثير للاهتمام ، تم العثور على التفاعل بين بروتين CD40 و umbelliferone لتعزيز الاستقرار الحراري لبروتين CD40. تمثل هذه الدراسة المحاولة الأولى للكشف عن إمكانات الارتباط لمركبات الجزيئات الصغيرة والبروتينات باستخدام الصفائح الدقيقة الفلورية والأصباغ الفلورية. تتميز هذه التقنية بحساسية ودقة عالية ، وتطورات واعدة في مجالات استقرار البروتين ، وبنية البروتين ، وتفاعلات البروتين والليجند ، مما يسهل المزيد من البحث والاستكشاف.

Vicatia thibetica H. Boissieu, a plant in the umbelliferous family, is commonly used in Tibetan medicine and represents one of the essential components of the five basic ingredients (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., and Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.)1. Mainly distributed in southwest China, such as northwest Yunnan, western Sichuan, Tibet, and other areas, its dried root serves as a local substitute for Angelica1. The root, known for its fragrance, is often utilized as a stew seasoning, and the leaves, referred to as Tibetan celery, contribute to delectable dishes. Thus, Vicatia thibetica holds significance not only as a unique medicinal plant but also as a food source in Tibet.
Both domestic and international research indicates that Vicatia thibetica possesses blood-replenishing and qi (power or energy)-invigorating properties, beneficial for regulating menstruation. It is employed to address symptoms of irregular menstrual dysmenorrhea caused by palpitation and blood deficiency, exhibiting pharmacological effects such as antioxidant regulation of body immunity2. The alcohol extract of Vicatia thibetica has demonstrated the ability to restore body mass and organ index in immunocompromised mice induced by cyclophosphamide. Additionally, it increases the activity of superoxide dismutase in serum and reduces the content of malondialdehyde, suggesting an improvement in antioxidant capacity and a balancing effect on lipid peroxidation2,3. Simultaneously, it enhances the number of blood cells and hemoglobin, which not only objectively reflects the body&#39;s hematopoietic function but also plays a crucial role in the immune system2,3.
Umbelliferone, characterized by acicular crystals and a bitter taste, possesses a small molecular weight, is volatile, and can be distilled with steam. It sublimates easily, has low solubility in water, and high solubility in organic matter. As one of the main chemical components of Vicatia thibetica, umbelliferone exhibits immunomodulatory effects on cellular immunity, humoral immunity, and non-specific immunity in hydrocortisone-induced immunosuppression mouse models4,5.
The cell surface molecule CD40, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, is widely expressed in immune cells6. Its homologous ligand, CD154, also known as CD40L, is a type II transmembrane protein expressed by activated T lymphocytes. CD40 activation has the capacity to up-regulate the expression of co-stimulatory molecules on the surface of dendritic cells (DC) and monocytes. This process promotes the antigen presentation function of major histocompatibility complex (MHC) molecules and further activates CD8+ T cells7.
Macrophages play a crucial role in the formation and regulation of the tumor microenvironment, and CD40 activation can enhance the remodeling of the tumor microenvironment by macrophages8. CD40 signal activation significantly influences the proliferation and activation of B cells. B cells, when activated by CD40, can function as effective antigen-presenting cells. They present antigens, generate effector T cell activity, and thereby contribute to anti-tumor effects9. Moreover, CD40 activation in tumor cells can induce apoptosis and inhibit tumor growth10. CD40 primarily transduces signals by controlling the activity of non-receptor tyrosine protein kinases, including Lyn, Fyn, Syk, and others. Additionally, it has the ability to stimulate Bcl-xL, Cdk4, and Cdk6 proteins, activate Rel/NF-kB transcription factors, and phosphorylate CG-2 and PI3K10.
The Differential Scanning Fluorescence (DSF) method is widely employed to assess the impact of various environmental conditions, such as buffer composition, temperature, and small molecule ligands, on the thermal stability of protein structures. The commonly utilized dye for DSF is an orange, environmentally sensitive, hydrophobic dye. Under normal conditions, the protein structure is folded, concealing its hydrophobic segment internally. As the temperature increases, the protein&#39;s hydrophobic region becomes more exposed, resulting in a gradual breakdown of the natural protein structure. The dye selectively binds to this exposed protein portion, amplifying its fluorescence. Tm values are then calculated by monitoring changes in the fluorescence signal detection11. To a certain extent, variations in Tm values can gauge shifts in protein stability due to mutations, changes in buffers, or ligand binding. Furthermore, it can indicate structural alterations during the protein folding process12. This approach offers precise data, a broad temperature range, high sensitivity, and minimal protein sample loss13.
In this study, fluorescence determination was conducted using a fluorescent microplate reader instead of a fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) apparatus. This modification enables DSF detection in laboratories lacking a fluorescent quantitative PCR instrument, making the method less complex and reducing the steps required for instrument setup, thereby simplifying the experimental process. However, there are certain drawbacks to this approach. While the complexity is reduced, the procedure becomes more cumbersome. Manual fluorescence detection at different temperatures is necessary, and automatic and continuous collection of fluorescence from the system cannot be achieved. Thus, this study utilized the DSF technique to explore the interaction between CD40 protein and umbelliferone, providing novel insights into the molecular mechanisms of Tibetan medicine.

تسليط الضوء على المؤلف: تبسيط طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحسين إمكانية الوصول والكفاءة

الكشف عن تفاعل البروتين والأمبيليفيرون CD40 عن طريق مضان المسح التفاضلي

Our protocol provides a significant advantage by allowing use without specialized equipment. Unlike traditional fluorescence quantitative PCR methods, it simplifies the experimental process, requiring fewer steps and reducing overall complexity, making it safer and easier to conduct. This experiment requires the operator to be very familiar with the experimental procedure and the fluorescent microplate reader, and not to waste too much time during the solution heating and the fluorescence detection.We will focus on the molecular mechanism by which umbelliferone binds to CD14 protein to produce immune effects.

أظهرت الصبغة البرتقالية باستمرار إثارة مضان مستقرة عند Ex = 470 نانومتر و Em = 570 نانومتر ، سواء في درجة حرارة الغرفة أو درجات الحرارة المرتفعة. تم تحديد نسبة التخفيف المثلى 1: 500 (الشكل 2 أ ، ب). ثبت أن الكشف عن قيمة Tm يمثل تحديا عندما كان تركيز بروتين CD40 أقل من 15 ميكروغرام ...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Streamlining PCR Methods for Enhanced Accessibility and Efficiency at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول طريقة فريدة للكشف عن الارتباط بين المركبات وجزيئات البروتين ، مما يوفر مزايا الحد الأدنى من فقدان عينة البروتين ودقة البيانات العالية.

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

يوفر بروتوكولنا ميزة كبيرة من خلال السماح بالاستخدام بدون معدات متخصصة. على عكس طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمية الفلورية التقليدية ، فإنه يبسط العملية التجريبية ، ويتطلب خطوات أقل ويقلل من التعقيد العام ، مما يجعله أكثر أمانا وأسهل في الإجراء. تتطلب هذه التجربة أن يكون المشغل على دراية كبيرة بالإجراء التجريبي وقارئ الألواح الدقيقة الفلورية ، وألا يضيع الكثير من الوقت أثناء تسخين المحلول واكتشاف التألق.سنركز على الآلية الجزيئية التي يرتبط بها أومبيليفيرون ببروتين CD14 لإنتاج تأثيرات مناعية.

الكشف عن تفاعل البروتين والأمبيليفيرون CD40 عن طريق مضان المسح التفاضلي

Abstract