אנו מביעים את הערכתנו הכנה לתמיכה הכספית שהתקבלה מפרויקט בניית הקונוטציה של תוכנית החומש ה -14 של האוניברסיטה לרפואה טיבטית (2022ZYYGH12), הנושאים הפתוחים 2022 של מעבדת המפתח של הרפואה הטיבטית וחינוך בסיסי של משרד החינוך באוניברסיטה לרפואה טיבטית (ZYYJC-22-04), תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית של נינגשיה (2023BEG02012), ופרויקט קידום המחקר Xinglin Scholar של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (XKTD2022013).

תמיסת התרכובת, תמיסת החלבונים והצבע הוכנסו לתמיסת PBS. לאחר מכן, הדגימות עברו חימום הדרגתי באמצעות חימום דיגיטלי המנער אמבטיה יבשה, והיציבות התרמית של החלבונים הוערכה על ידי מדידת השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות במערכת המורכבת. השלבים המפורטים מתוארים להלן, ואיור 1 ממחיש סקיר...

זיהוי רגישות גבוהה של קשירת תרכובת-חלבון באמצעות פלואורסצנטיות

<ol>
	<li>Cairang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+standardization+of+clinical+application+of+Tibetan+medicine+&amp;#34;five+roots&amp;#34.">Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine &amp;#34;five roots&amp;#34.</a> Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136 (2022).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Xigui+extract+on+immunosuppressive+mice+induced+by+cyclophosphamide.">Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide.</a> Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Vicatia+thibertica+de+boiss+on+immunologic+and+hematopoietic+function+of+mice.">Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice.</a> J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).</li><li>Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+constituents,+quality+control+and+pharmacology+research+progress+of+Xigui.">Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui.</a> Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+total+flavone+extract+from+Shuiqin+(Oenanthe+Javanica)+on+immune+function+of+immunosuppression+mice.">Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice.</a> Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).</li><li>Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+agonist+antibodies+in+cancer+immunotherapy.">CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy.</a> Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).</li><li>Grewal, I. S., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+and+CD154+in+cell-mediated+immunity.">CD40 and CD154 in cell-mediated immunity.</a> Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).</li><li>Long, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+and+CCL2+cooperate+to+redirect+tumor-infiltrating+monocytes+to+degrade+fibrosis+and+enhance+chemotherapy+efficacy+in+pancreatic+carcinoma.">IFN&#947; and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma.</a> Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+regulatory+B+cells+in+cancer.">The roles of regulatory B cells in cancer.</a> J Immunol Res. 2014, 215471 (2014).</li><li>Eliopoulos, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+induces+apoptosis+in+carcinoma+cells+through+activation+of+cytotoxic+ligands+of+the+tumor+necrosis+factor+superfamily.">CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily.</a> Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).</li><li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability.">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).</li><li>Rosa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meltdown:+A+Tool+to+help+in+the+interpretation+of+thermal+melt+curves+acquired+by+differential+scanning+fluorimetry.">Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry.</a> J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).</li><li>Hellman, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+based+assessments+of+the+thermal+and+kinetic+stability+of+peptide-MHC+complexes.">Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes.</a> J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).</li><li>Gorny, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+nano-differential+scanning+fluorimetry+and+microscale+thermophoresis+to+investigate+VDAC1+interaction+with+small+molecules.">Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules.</a> J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821 (2023).</li><li>Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+denaturation+methods+in+the+study+of+protein+folding.">Thermal denaturation methods in the study of protein folding.</a> Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).</li><li>Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical,+thermal+and+morphological+properties+of+polybutylene+succinate-waste+pineapple+leaf+fibres+composites.">Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites.</a> Heliyon. 9 (11), 21238 (2023).</li><li>Zhou, C., Yu, M., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparation+of+three+measuring+methods+for+thermodynamic+stability+of+protein.">Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein.</a> Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway.">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568 (2023).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside,+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata,+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1/p53/Drp1+signaling.">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).</li><li>Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+tool+to+study+protein+interactions+and+their+implication+in+human+diseases.">Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (14), 7672 (2022).</li><li>Kamat, V., Rafique, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+binding+kinetic+assay+on+the+bio-layer+interferometry+(BLI)+biosensor+to+characterize+antibody-antigen+interactions.">Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions.</a> Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).</li><li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atosiban+and+Rutin+exhibit+anti-mycobacterial+activity+-+An+integrated+computational+and+biophysical+insight+toward+drug+repurposing+strategy+against+Mycobacterium+tuberculosis+targeting+its+essential+enzyme+HemD.">Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD.</a> Int J Biol Macromol. 253, 127208 (2023).</li><li>Gr&#228;dler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+structural+characterization+of+the+impacts+of+MET+phosphorylation+on+tepotinib+binding.">Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105328 (2023).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+and+its+application+in+the+study+of+protein.">Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein.</a> Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).</li></ol>

DSF, הידועה גם בשם בדיקת שינוי תרמי או בדיקת פלואורסצנטיות תרמית, היא טכניקה המשמשת לזיהוי תהליך של דנטורציה תרמית של חלבונים בדגימות על ידי ניטור שינויים באות הפלואורסצנטי של דגימת הבדיקה או הצבע במהלך עליית טמפרטורה איטית ומתוכנתת. DSF, שהוקמה לראשונה על ידי פנטוליאנו14, משמשת ...

Vicatia thibetica H. Boissieu, צמח ממשפחת האומבליפיים, נפוץ ברפואה הטיבטית ומייצג את אחד המרכיבים החיוניים של חמשת המרכיבים הבסיסיים (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., ו - Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. מופץ בעיקר בדרום מערב סין, כגון צפון מערב יונאן, מערב סצ'ואן, טיבט ואזורים נוספים, השורש המיובש שלו משמש תחליף מקומי לאנג'ליקה1. השורש, הידוע בניחוחו, משמש לעתים קרובות כתיבול תבשיל, והעלים, המכונים סלרי טיבטי, תורמים למאכלים טעימים. לפיכך, Vicatia thibetica הוא בעל משמעות לא רק כצמח מרפא ייחודי אלא גם כמקור מזון בטיבט.
מחקרים מקומיים ובינלאומיים מצביעים על כך ש- Vicatia thibetica היא בעלת תכונות ממריצות דם וצ'י (כוח או אנרגיה), המועילות להסדרת הווסת. הוא משמש לטיפול בסימפטומים של דיסמנוריאה וסתית לא סדירה הנגרמת על ידי דפיקות לב ומחסור בדם, ומציג השפעות פרמקולוגיות כגון ויסות נוגד חמצון של חסינות הגוף2. תמצית האלכוהול של Vicatia thibetica הדגימה את היכולת לשחזר את מסת הגוף ואת אינדקס האיברים בעכברים מדוכאי חיסון המושרים על ידי cyclophosphamide. בנוסף, הוא מגביר את הפעילות של סופראוקסיד דיסמוטאז בסרום ומפחית את התוכן של malondialdehyde, מה שמרמז על שיפור ביכולת נוגדת חמצון והשפעה מאזנת על חמצון שומנים 2,3. במקביל, הוא משפר את מספר תאי הדם וההמוגלובין, אשר לא רק משקף באופן אובייקטיבי את התפקוד ההמטופויטי של הגוף, אלא גם ממלא תפקיד מכריע במערכת החיסון 2,3.
Umbelliferone, המאופיין גבישים acicular טעם מר, בעל משקל מולקולרי קטן, הוא נדיף, והוא יכול להיות מזוקק עם אדים. הוא עובר סובלימציה בקלות, בעל מסיסות נמוכה במים ומסיסות גבוהה בחומר אורגני. כאחד המרכיבים הכימיים העיקריים של Vicatia thibetica, umbelliferone מציג השפעות אימונומודולטוריות על חסינות תאית, חסינות הומורלית וחסינות לא ספציפית במודלים של עכברי דיכוי חיסוניהמושרה על ידי הידרוקורטיזון 4,5.
מולקולת פני התא CD40, חברה במשפחת קולטני גורם נמק הגידול, מתבטאת באופן נרחב בתאי מערכת החיסון6. הליגנד ההומולוגי שלו, CD154, הידוע גם בשם CD40L, הוא חלבון טרנסממברנה מסוג II המתבטא על ידי לימפוציטים פעילים מסוג T. להפעלת CD40 יש את היכולת לווסת את הביטוי של מולקולות קו-סטימולטוריות על פני השטח של תאים דנדריטיים (DC) ומונוציטים. תהליך זה מקדם את פונקציית הצגת האנטיגן של מולקולות מורכבות היסטותאימות עיקריות (MHC) ומפעיל עוד יותר תאי CD8+ T7.
מקרופאגים ממלאים תפקיד מכריע בהיווצרות ובוויסות של מיקרו-סביבת הגידול, והפעלת CD40 יכולה לשפר את העיצוב מחדש של מיקרו-סביבת הגידול על ידי מקרופאגים8. הפעלת אות CD40 משפיעה באופן משמעותי על התרבות והפעלה של תאי B. תאי B, כאשר מופעלים על ידי CD40, יכולים לתפקד כתאים מציגי אנטיגן יעילים. הם מציגים אנטיגנים, מייצרים פעילות תאי T משפיעים, ובכך תורמים להשפעות אנטי-סרטניות9. יתר על כן, הפעלת CD40 בתאי הגידול יכולה לגרום לאפופטוזיס ולעכב את צמיחת הגידול10. CD40 בעיקר מתמיר אותות על ידי שליטה בפעילות של קינאזות חלבון טירוזין שאינן קולטנות, כולל לין, פין, סייק ואחרים. בנוסף, יש לו את היכולת לעורר חלבונים Bcl-xL, Cdk4 ו- Cdk6, להפעיל גורמי שעתוק Rel/NF-kB, ופוספורילט CG-2 ו- PI3K10.
שיטת פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית (DSF) נמצאת בשימוש נרחב כדי להעריך את ההשפעה של תנאים סביבתיים שונים, כגון הרכב חיץ, טמפרטורה וליגנדות של מולקולות קטנות, על היציבות התרמית של מבני חלבונים. הצבע הנפוץ עבור DSF הוא צבע כתום, רגיש לסביבה, הידרופובי. בתנאים רגילים, מבנה החלבון מקופל, ומסתיר את המקטע ההידרופובי שלו מבפנים. ככל שהטמפרטורה עולה, האזור ההידרופובי של החלבון נחשף יותר, וכתוצאה מכך מתפרק בהדרגה מבנה החלבון הטבעי. הצבע נקשר באופן סלקטיבי לחלק חלבוני חשוף זה, ומגביר את הפלואורסצנטיות שלו. ערכי Tm מחושבים לאחר מכן על ידי ניטור שינויים בזיהוי אות פלואורסצנטי11. במידה מסוימת, שינויים בערכי המדיטציה הטרנסנדנטלית יכולים לאמוד שינויים ביציבות החלבונים עקב מוטציות, שינויים במאגרים או קשירת ליגנדים. יתר על כן, הוא יכול להצביע על שינויים מבניים בתהליך קיפול החלבונים12. גישה זו מציעה נתונים מדויקים, טווח טמפרטורות רחב, רגישות גבוהה ואובדן דגימת חלבון מינימלי13.
במחקר זה, קביעת פלואורסצנטיות בוצעה באמצעות קורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי במקום מנגנון תגובת שרשרת פולימראז כמותי פלואורסצנטי (PCR). שינוי זה מאפשר זיהוי DSF במעבדות ללא מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי, מה שהופך את השיטה לפחות מורכבת ומפחית את השלבים הנדרשים להתקנת המכשיר, ובכך מפשט את תהליך הניסוי. עם זאת, ישנם חסרונות מסוימים לגישה זו. בעוד המורכבות מצטמצמת, ההליך הופך מסורבל יותר. יש צורך בזיהוי פלואורסצנטי ידני בטמפרטורות שונות, ולא ניתן להשיג איסוף אוטומטי ורציף של פלואורסצנטיות מהמערכת. לפיכך, מחקר זה השתמש בטכניקת DSF כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבון CD40 לבין umbelliferone, ומספק תובנות חדשות על המנגנונים המולקולריים של הרפואה הטיבטית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD40 protein</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-P75408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexStation 3 multifunctional microplate reader</td>
			<td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td>
			<td>FlexStation 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>v8.0724(B724)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8120485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro 7.1</td>
			<td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td>
			<td>SoftMax Pro 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSYPRO orange dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbelliferone</td>
			<td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co.</td>
			<td>B21854</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cd40 protein-umbelliferone interaction via differential scanning fluorescence

חקירת אינטראקציות בין מולקולות שונות היא היבט מכריע בהבנת פתוגנזה של מחלות וסינון מטרות תרופות. Umbelliferone, מרכיב פעיל ברפואה הטיבטית Vicatia thibetica, מציג אפקט אימונומודולטורי עם מנגנון לא ידוע. חלבון CD40 הוא מטרה מרכזית בתגובה החיסונית. לכן, מחקר זה משתמש בעיקרון של סריקה דיפרנציאלית טכנולוגיית פלואורסצנטיות כדי לנתח את האינטראקציות בין חלבון CD40 לבין umbelliferone באמצעות סמנים אנזימים פלואורסצנטיים. בתחילה, יציבות הצבע הכתום הפלואורסצנטי של החלבון אומתה בניסוי, ונקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500. לאחר מכן, נצפתה כי ערך המסת הטמפרטורה (Tm) של חלבון CD40 נטה לרדת עם עלייה בריכוז. באופן מעניין, האינטראקציה בין חלבון CD40 לבין umbelliferone נמצאה כמשפרת את היציבות התרמית של חלבון CD40. מחקר זה מייצג את הניסיון הראשון לזהות את פוטנציאל הקישור של תרכובות מולקולות קטנות וחלבונים באמצעות מיקרו-צלחות פלואורסצנטיות וצבעים פלואורסצנטיים. הטכניקה מאופיינת ברגישות ודיוק גבוהים, ומבטיחה התקדמות בתחומי יציבות החלבון, מבנה החלבונים ואינטראקציות חלבון-ליגנד, ובכך מאפשרת מחקר וחקירה נוספים.

Vicatia thibetica H. Boissieu, a plant in the umbelliferous family, is commonly used in Tibetan medicine and represents one of the essential components of the five basic ingredients (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., and Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.)1. Mainly distributed in southwest China, such as northwest Yunnan, western Sichuan, Tibet, and other areas, its dried root serves as a local substitute for Angelica1. The root, known for its fragrance, is often utilized as a stew seasoning, and the leaves, referred to as Tibetan celery, contribute to delectable dishes. Thus, Vicatia thibetica holds significance not only as a unique medicinal plant but also as a food source in Tibet.
Both domestic and international research indicates that Vicatia thibetica possesses blood-replenishing and qi (power or energy)-invigorating properties, beneficial for regulating menstruation. It is employed to address symptoms of irregular menstrual dysmenorrhea caused by palpitation and blood deficiency, exhibiting pharmacological effects such as antioxidant regulation of body immunity2. The alcohol extract of Vicatia thibetica has demonstrated the ability to restore body mass and organ index in immunocompromised mice induced by cyclophosphamide. Additionally, it increases the activity of superoxide dismutase in serum and reduces the content of malondialdehyde, suggesting an improvement in antioxidant capacity and a balancing effect on lipid peroxidation2,3. Simultaneously, it enhances the number of blood cells and hemoglobin, which not only objectively reflects the body&#39;s hematopoietic function but also plays a crucial role in the immune system2,3.
Umbelliferone, characterized by acicular crystals and a bitter taste, possesses a small molecular weight, is volatile, and can be distilled with steam. It sublimates easily, has low solubility in water, and high solubility in organic matter. As one of the main chemical components of Vicatia thibetica, umbelliferone exhibits immunomodulatory effects on cellular immunity, humoral immunity, and non-specific immunity in hydrocortisone-induced immunosuppression mouse models4,5.
The cell surface molecule CD40, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, is widely expressed in immune cells6. Its homologous ligand, CD154, also known as CD40L, is a type II transmembrane protein expressed by activated T lymphocytes. CD40 activation has the capacity to up-regulate the expression of co-stimulatory molecules on the surface of dendritic cells (DC) and monocytes. This process promotes the antigen presentation function of major histocompatibility complex (MHC) molecules and further activates CD8+ T cells7.
Macrophages play a crucial role in the formation and regulation of the tumor microenvironment, and CD40 activation can enhance the remodeling of the tumor microenvironment by macrophages8. CD40 signal activation significantly influences the proliferation and activation of B cells. B cells, when activated by CD40, can function as effective antigen-presenting cells. They present antigens, generate effector T cell activity, and thereby contribute to anti-tumor effects9. Moreover, CD40 activation in tumor cells can induce apoptosis and inhibit tumor growth10. CD40 primarily transduces signals by controlling the activity of non-receptor tyrosine protein kinases, including Lyn, Fyn, Syk, and others. Additionally, it has the ability to stimulate Bcl-xL, Cdk4, and Cdk6 proteins, activate Rel/NF-kB transcription factors, and phosphorylate CG-2 and PI3K10.
The Differential Scanning Fluorescence (DSF) method is widely employed to assess the impact of various environmental conditions, such as buffer composition, temperature, and small molecule ligands, on the thermal stability of protein structures. The commonly utilized dye for DSF is an orange, environmentally sensitive, hydrophobic dye. Under normal conditions, the protein structure is folded, concealing its hydrophobic segment internally. As the temperature increases, the protein&#39;s hydrophobic region becomes more exposed, resulting in a gradual breakdown of the natural protein structure. The dye selectively binds to this exposed protein portion, amplifying its fluorescence. Tm values are then calculated by monitoring changes in the fluorescence signal detection11. To a certain extent, variations in Tm values can gauge shifts in protein stability due to mutations, changes in buffers, or ligand binding. Furthermore, it can indicate structural alterations during the protein folding process12. This approach offers precise data, a broad temperature range, high sensitivity, and minimal protein sample loss13.
In this study, fluorescence determination was conducted using a fluorescent microplate reader instead of a fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) apparatus. This modification enables DSF detection in laboratories lacking a fluorescent quantitative PCR instrument, making the method less complex and reducing the steps required for instrument setup, thereby simplifying the experimental process. However, there are certain drawbacks to this approach. While the complexity is reduced, the procedure becomes more cumbersome. Manual fluorescence detection at different temperatures is necessary, and automatic and continuous collection of fluorescence from the system cannot be achieved. Thus, this study utilized the DSF technique to explore the interaction between CD40 protein and umbelliferone, providing novel insights into the molecular mechanisms of Tibetan medicine.

מחבר זרקור: ייעול שיטות PCR לשיפור הנגישות והיעילות

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

Our protocol provides a significant advantage by allowing use without specialized equipment. Unlike traditional fluorescence quantitative PCR methods, it simplifies the experimental process, requiring fewer steps and reducing overall complexity, making it safer and easier to conduct. This experiment requires the operator to be very familiar with the experimental procedure and the fluorescent microplate reader, and not to waste too much time during the solution heating and the fluorescence detection.We will focus on the molecular mechanism by which umbelliferone binds to CD14 protein to produce immune effects.

הצבע הכתום הפגין באופן עקבי עירור פלואורסצנטי יציב ב- Ex = 470 ננומטר ו- Em = 570 ננומטר, הן בטמפרטורת החדר והן בטמפרטורות גבוהות. נקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500 (איור 2A,B). זיהוי ערך המדיטציה הטרנסנדנטלית היה מאתגר כאשר ריכוז חלבון CD40 היה מתחת ל-15 מק"ג/מ"ל (איור 3A,...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Streamlining PCR Methods for Enhanced Accessibility and Efficiency at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

הפרוטוקול שלנו מספק יתרון משמעותי בכך שהוא מאפשר שימוש ללא ציוד מיוחד. בניגוד לשיטות PCR כמותיות פלואורסצנטיות מסורתיות, היא מפשטת את תהליך הניסוי, דורשת פחות שלבים ומפחיתה את המורכבות הכוללת, מה שהופך אותו לבטוח וקל יותר לביצוע. ניסוי זה דורש מהמפעיל להכיר היטב את הליך הניסוי ואת קורא המיקרו-צלחות הפלואורסצנטיות, ולא לבזבז זמן רב מדי במהלך חימום התמיסה וגילוי הפלואורסצנטיות.נתמקד במנגנון המולקולרי שבאמצעותו אומבליפרון נקשר לחלבון CD14 כדי לייצר השפעות חיסוניות.

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

Abstract