Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המדגים את השימוש בהידרוג'ל כמסגרת תלת ממדית (3D) לתרבית תאי גזע שמקורם בשומן (ADSC) ומציגים פוטוביומודולציה (PBM) כדי להגביר את התפשטות ADSCs במסגרת התרבית התלת-ממדית.

Abstract

תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs), בעלי תכונות מזנכימליות רב-עוצמה הדומות לתאי גזע, משמשים לעתים קרובות ברפואה רגנרטיבית בשל יכולתם למגוון רחב של התמיינות תאים ויכולתם להגביר את הנדידה, ההתרבות ולמתן דלקת. עם זאת, ADSCs לעתים קרובות להתמודד עם אתגרים בהישרדות וקליטה בתוך פצעים, בעיקר בשל תנאים דלקתיים שליליים. כדי לטפל בבעיה זו, הידרוג'לים פותחו כדי לשמור על כדאיות ADSC בפצעים ולזרז את תהליך ריפוי הפצע. כאן, שאפנו להעריך את ההשפעה הסינרגטית של פוטוביומודולציה (PBM) על התפשטות ADSC וציטוטוקסיות במסגרת תרבית תאים תלת-ממדית. ADSCs אימורטליים נזרעו לתוך הידרוג'לים של 10 μL בצפיפות של 2.5 x 103 תאים והיו נתונים לקרינה באמצעות דיודות 525 ננומטר ו 825 ננומטר בשטף של 5 J / cm2 ו 10 J / cm2. שינויים מורפולוגיים, ציטוטוקסיות והתפשטות הוערכו 24 שעות ו-10 ימים לאחר החשיפה ל-PBM. ה-ADSCs הציגו מורפולוגיה מעוגלת ופוזרו לאורך הג'ל כתאים בודדים או כאגרגטים ספרואידים. חשוב לציין, הן PBM והן מסגרת תרבית תלת-ממדית לא הציגו השפעות ציטוטוקסיות על התאים, בעוד PBM שיפר באופן משמעותי את שיעורי ההתרבות של ADSCs. לסיכום, מחקר זה מדגים את השימוש בהידרוג'ל כסביבה תלת-ממדית מתאימה לתרבית ADSC ומציג PBM כאסטרטגיית הגדלה משמעותית, במיוחד תוך התייחסות לקצב ההתרבות האיטי הקשור לתרבית תאים תלת-ממדית.

Introduction

ADSCs הם תאי אב מזנכימליים רב-פוטנטיים בעלי יכולת לחדש את עצמם ולהתמיין למספר שושלות תאים. תאים אלה ניתן לקצור מן החלק כלי הדם סטרומה (SVF) של רקמת השומן במהלך הליך lipoaspiration1. ADSCs התגלו כסוג תאי גזע אידיאלי לשימוש ברפואה רגנרטיבית מכיוון שתאים אלה נמצאים בשפע, זעיר פולשניים לקציר, נגישים בקלות ומאופיינים היטב2. טיפול בתאי גזע מציע אפיק אפשרי לריפוי פצעים על ידי גירוי נדידת תאים, התפשטות, ניאו-וסקולריזציה והפחתת דלקת בתוך פצעים 3,4. כ-80% מיכולת ההתחדשות של ADSCs מיוחסת לאיתות פרקריני באמצעות ההפרשה5 שלהם. בעבר, הוצע כי הזרקה מקומית....

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה. הפרוטוקול סוכם באופן גרפי באיור 1.

1. תרבית תאים דו-ממדית (2D)

הערה: ADSCs אימורטליים (1 x106 תאים) מאוחסנים ב -195.8 ° C בחנקן נוזלי ?.......

Representative Results

כדי להעריך את המורפולוגיה ולבחון חזותית את צפיפות התאים של ההידרוג'לים, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך (איור 2). ה-ADSCs שמרו על מורפולוגיה מעוגלת 24 שעות לאחר הזריעה והחשיפה ל-PBM. התאים היו מפוזרים ברחבי הג'ל כתאים בודדים או באשכולות דמויי ענבים. המורפולוגיה נותרה ללא שינוי לאחר 10 י.......

Discussion

ADSCs הם סוג תא אידיאלי לשימוש ברפואה רגנרטיבית מכיוון שהם מעוררים תהליכים שונים המסייעים בריפוי פצעים 3,4. עם זאת, ישנם מספר אתגרים שיש לעקוף, למשל, שיעורי הישרדות ירודים וקליטה לא יעילה של התאים באתר פציעה9. תאים אימורטליים שימשו כקו תאים זמין מסח.......

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי קרן המחקר הלאומית של דרום אפריקה Thuthuka Instrument, מענק מספר TTK2205035996; מרכז הלייזר האפריקאי (ALC) במימון המחלקה למדע וחדשנות (DSI), מספר מענק HLHA23X המשימה ALC-R007; מועצת המחקר האוניברסיטאית, מענק מספר 2022URC00513; יוזמת קתדרות המחקר של המחלקה למדע וטכנולוגיה בדרום אפריקה (DST-NRF/SARChI), מענק מספר 98337. הגופים המממנים לא מילאו כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף, בניתוח, בפענוח הנתונים או בכתיבת כתב היד. המחברים מודים לאוניברסיטת יוהנסבורג (UJ) ולמרכז לחקר לייזר (LRC) על השימוש שלהם במתקנים ובמשאבים.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
525 nm diode laserNational Laser Centre of South AfricaEN 60825-1:2007
825 nm diode laserNational Laser Centre of South AfricaSN 101080908ADR-1800
96 Well Strip PlatesSigma-AldrichBR782301
Amphotericin BSigma-AldrichA2942Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9681ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic VialCorning430659cryovial
CryoSOfreeSigma-AldrichC9249Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity AssayPromegaG1780Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle MediaSigma-AldrichD5796Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power MeterCoherent1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plateSigma-AldrichCLS3370
Foetal bovine serumBiochromS0615Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Sigma-AldrichH9394Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubatorThermo Scientific51026280
Heraeus Labofuge 400Thermo Scientific75008371Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifugeThermoFisher75004270
Immortalized ADSCsATCCASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000Passage 37
Invitrogen Countess 3InvitrogenAMQAX2000Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbathSigma-AldrichZ615501Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens EntryOlympusVersion 3.2 (23706) Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41OlympusSN9B02019Inverted light microscope
Olympus SC30 cameraOlympusSN57000530Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplatesSigma-AldrichCLS3912Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3Sigma-AldrichTRUE3-1KT10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery SolutionSigma-AldrichTRUEENZ01:20
Trypan Blue StainThermo Fisher - InvitrogenT102820.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)Gibco12563029Cell detachment solution
Victor Nivo Plate ReaderPerkin ElmerHH3522019094Spectrophotometric plate reader

References

Explore More Articles

206

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved