Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים שיטה לביאור וסיווג מבוססי ספקטרומטריית מסה מהירה (MS)/ספקטרומטריית מסה (MS) של אלקלואידים טרופאניים, שימושית הן לשכפול ראשוני של דגימות המכילות טרופאן והן לגילוי אלקלואידים חדשים לבידוד.

Abstract

למרות שתרופות רבות המשמשות כיום הן סינתטיות במקורן, מוצרים טבעיים עדיין מספקים מקור עשיר למגוון כימי חדש ולפעילות ביולוגית, ויכולים להניב לידים מבטיחים למחלות עמידות או מתפתחות. האתגר, עם זאת, הוא כפול: לא רק שעל החוקרים למצוא תוצרים טבעיים ולהבהיר את המבנים שלהם, אלא עליהם גם לזהות מה כדאי לבודד ולבדוק (ומה שכבר ידוע - תהליך המכונה dereplication). עם הופעתו של מכשור אנליטי מודרני, קצב הגילוי והשכפול של מוצרים טבעיים הואץ. ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית טנדם (LC-MS/MS) הפכה לטכניקה בעלת ערך רב במיוחד לזיהוי וסיווג מבנים כימיים. אלקלואידים טרופאן (TAs) הם תרכובות צמחיות בעלות חשיבות רפואית וטוקסיקולוגית רבה. במחקר זה, פיתחנו זרימת עבודה של סינון מבוססת LC-MS/MS תוך שימוש בתצורות MS/MS המרובות הזמינות בספקטרומטר מסות משולש מרובע (QQQ) כדי להוסיף הערות ולסווג מבני TA בהתבסס על דפוסי הפיצול הייחודיים שלהם. על ידי שימוש בשילוב של סריקות יוני מוצר תלויות נתונים (DD), סריקות יונים מקדימות (PrIS) וסריקות אובדן ניטרליות (NLS), יישמנו שיטה זו על תמציות עשירות בת"א של הסוליות Datura stramonium ו - Datura metel. שיטה זו היא מהירה, רגישה, ושימשה בהצלחה הן לשכפול ראשוני של דגימות מורכבות המכילות TA והן לגילוי מועמד חדש לבידוד, טיהור (ובסופו של דבר ביו-אסיה).

Introduction

אף על פי שמולקולות סינתטיות לחלוטין הפכו לבולטות יותר בגילוי תרופות בעשורים האחרונים, כמעט שני שלישים מכל התרופות שאושרו ב-39 השנים האחרונות הן מוצרים טבעיים או בהשראת מוצרים טבעיים,1,2  מה שמדגיש את החשיבות המתמשכת של מחקר מוצרים טבעיים. אלקלואידים, מוצרים טבעיים מסוימים המכילים חנקן, מוערכים במיוחד בזכות תכונותיהם הרפואיות. אלקלואידים טרופאן (TAs) המכילים את [3.2.1.]- מערכת דו-גלגלית המכילה חנקן, מיוצרת בעיקר על ידי צמחים ממשפחות הסולניים (סולניים), אריתרוקסילאיים (Erythroxylaceae) וקונבולוולוסיים (Convolvulaceae). דוגמאות כוללות אטרופין, סקופולמין וקוקאין; מספר ט....

Protocol

התראה: עיין בכל גיליונות נתוני בטיחות החומרים הרלוונטיים (MSDS) לפני השימוש בכימיקלים הרשומים.

1. הכנת מדגם

אזהרה: חנקן נוזלי עלול לגרום לכוויות קריוגן. יש להשתמש בכפפות קריוגן והגנה על העיניים באזור מאוורר היטב. דגימות צמחים המכילות א.......

Representative Results

כדי להדגים את יעילות השיטה, תערובת סטנדרטית של TAs (10 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד מתערובת אצטילטרופין/אצטיל-פסאודוטרופין [monosubstituted], 10 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד מתערובת של שני איזומרים אניסודאמינים [disubstituted], יחד עם hyoscyamine [monosubstituted], littorine [monosubstituted] ו-scopolamine [trisubstituted]) נותחה כבקרה חיובית (

Discussion

למרות שהפרמטרים של המכשיר המסופקים בפרוטוקול מאפשרים ביצועים משביעי רצון, השימוש המוצלח בשיטה זו עשוי לדרוש תשומת לב קפדנית או אופטימיזציה של מספר שלבים קריטיים. בעוד ששיפוע הממס HPLC המסופק בשלב 2.2 מתאים בדרך כלל לאלקלואידים טרופניים, ייתכן שיהיה צורך לשנות אותו בהתאם ל?.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי מענק מחקר פקולטי (אוניברסיטת צפון מישיגן, הוענק ל- M.A.C.), מלגת מחקר לתואר ראשון (אוניברסיטת צפון מישיגן, הוענקה ל- J.C) והמחלקה לכימיה. המחברים רוצים להודות לג'ון ברגר (NMU) על הסיוע בהכנת רקמות צמחים, לחנה הוקינס (NMU) על התחזוקה של LC-MS ולסיוע בפתרון בעיות, ולד"ר ריאן פורנוולד ותלמידיו CH 495 (סינתזת מוצרים טבעיים) על הכנת תערובת אצטילטרופין. המחברים מבקשים גם להודות לד"ר דניאל ג'ונס (אוניברסיטת מישיגן) על רכישת ספקטרום MS/MS ברזולוציה גבוהה.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900667HPLC solvent
Argon gasAirGasAR UHP300CID gas
Formic acid, 99% for analysisThermo ScientificAC270480010HPLC additive
Guard column holderRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogenAirGasNI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400For making extraction solvent
Microcentrifuge VWR2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Mortar Fisher ScientificFB961CFor grinding plant tissues
PestleFisher ScientificFB961MFor grinding plant tissues
Pipette 1000 mLGilson F144059M
Pipette tip 1000 mLFisher scientific02-707-404
Plant tissuesVarious sourcesN/ACan be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Polystyrene coolerULINES-18312The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mmRestek9534315HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Guard column
Rocking shakerThemo Scientific11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)Fisher scientific13-622-190LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Syringe filter 0.45 µm Avantor/VWR76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometryJT Baker9831-03For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900687-1LHPLC solvent

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
  2. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

LC MS MSDatura

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved