Applicazioni della cromatografia liquida Spettrometria di massa tandem nella ricerca sui prodotti naturali: alcaloidi tropanici come caso di studio

Summary

Presentiamo un metodo per l'annotazione e la classificazione rapida basata sulla spettrometria di massa (MS) e sulla spettrometria di massa (MS) degli alcaloidi tropanici, utile sia per la dereplicazione preliminare di campioni contenenti tropani che per la scoperta di nuovi alcaloidi per l'isolamento.

Abstract

Sebbene molti farmaci utilizzati oggi siano di origine sintetica, i prodotti naturali forniscono ancora una ricca fonte di nuova diversità chimica e bioattività e possono produrre spunti promettenti per malattie resistenti o emergenti. La sfida, tuttavia, è duplice: non solo i ricercatori devono trovare prodotti naturali e chiarire le loro strutture, ma devono anche identificare ciò che vale la pena isolare e analizzare (e ciò che è già noto - un processo noto come dereplicazione). Con l'avvento della moderna strumentazione analitica, il ritmo della scoperta e della dereplicazione dei prodotti naturali è accelerato. La cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) è diventata una tecnica particolarmente preziosa per identificare e classificare le strutture chimiche. Gli alcaloidi tropanici (TA) sono composti di origine vegetale di grande importanza medicinale e tossicologica. In questo studio, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di screening basato su LC-MS/MS utilizzando le molteplici configurazioni MS/MS disponibili su uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo (QQQ) per annotare e classificare le strutture TA in base ai loro distinti modelli di frammentazione. Utilizzando una combinazione di scansioni ioniche del prodotto dipendenti dai dati (DD), scansioni ioniche precursori (PrIS) e scansioni con perdita neutra (NLS), abbiamo applicato questo metodo agli estratti ricchi di TA della belladonna Datura stramonium e Datura metel. Questo metodo è rapido, sensibile ed è stato impiegato con successo sia per la dereplicazione preliminare di campioni complessi contenenti TA sia per la scoperta di un nuovo candidato per l'isolamento, la purificazione (e l'eventuale biodosaggio).

Introduction

Sebbene le molecole completamente sintetiche siano diventate più importanti nella scoperta di farmaci negli ultimi decenni, quasi due terzi di tutti i farmaci approvati negli ultimi 39 anni sono prodotti naturali o ispirati a prodotti ^naturali,1,2  sottolineando la continua importanza della ricerca sui prodotti naturali. Gli alcaloidi, alcuni prodotti naturali contenenti azoto, sono particolarmente apprezzati per le loro proprietà medicinali. Alcaloidi tropanici (TA) contenenti il [3.2.1.]-sistema biciclico contenente azoto, sono prodotti principalmente da piante de....

Protocol

ATTENZIONE: Consultare tutte le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) pertinenti prima di utilizzare le sostanze chimiche elencate.

1. Preparazione del campione

ATTENZIONE: L'azoto liquido può causare ustioni da criogeno. Utilizzare guanti criogenici e protezione per gli occhi in un'area ben ventilata. I campioni di piante contenenti alcaloidi possono essere irritanti per la pelle; Maneggiarli sempre con i guanti........

Discussion

Sebbene i parametri dello strumento forniti nel protocollo consentano prestazioni soddisfacenti, l'uso efficace di questo metodo può richiedere un'attenta attenzione o l'ottimizzazione di diversi passaggi critici. Sebbene il gradiente di solvente HPLC fornito nella fase 2.2 sia generalmente appropriato per gli alcaloidi tropanici, potrebbe essere necessario modificarlo a seconda del profilo alcaloide tropanico del campione o della specie vegetale esaminata. Il volume di iniezione del ca.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900667	HPLC solvent
Argon gas	AirGas	AR UHP300	CID gas
Formic acid, 99% for analysis	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC additive
Guard column holder	Restek	25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogen	AirGas	NI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	For making extraction solvent
Microcentrifuge	VWR	2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Mortar	Fisher Scientific	FB961C	For grinding plant tissues
Pestle	Fisher Scientific	FB961M	For grinding plant tissues
Pipette 1000 mL	Gilson	F144059M
Pipette tip 1000 mL	Fisher scientific	02-707-404
Plant tissues	Various sources	N/A	Can be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
Polystyrene cooler	ULINE	S-18312	The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	Guard column
Rocking shaker	Themo Scientific	11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)	Fisher scientific	13-622-190	LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
Syringe filter 0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry	JT Baker	9831-03	For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC solvent