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Presentiamo un metodo per l'annotazione e la classificazione rapida basata sulla spettrometria di massa (MS) e sulla spettrometria di massa (MS) degli alcaloidi tropanici, utile sia per la dereplicazione preliminare di campioni contenenti tropani che per la scoperta di nuovi alcaloidi per l'isolamento.
Sebbene molti farmaci utilizzati oggi siano di origine sintetica, i prodotti naturali forniscono ancora una ricca fonte di nuova diversità chimica e bioattività e possono produrre spunti promettenti per malattie resistenti o emergenti. La sfida, tuttavia, è duplice: non solo i ricercatori devono trovare prodotti naturali e chiarire le loro strutture, ma devono anche identificare ciò che vale la pena isolare e analizzare (e ciò che è già noto - un processo noto come dereplicazione). Con l'avvento della moderna strumentazione analitica, il ritmo della scoperta e della dereplicazione dei prodotti naturali è accelerato. La cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) è diventata una tecnica particolarmente preziosa per identificare e classificare le strutture chimiche. Gli alcaloidi tropanici (TA) sono composti di origine vegetale di grande importanza medicinale e tossicologica. In questo studio, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di screening basato su LC-MS/MS utilizzando le molteplici configurazioni MS/MS disponibili su uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo (QQQ) per annotare e classificare le strutture TA in base ai loro distinti modelli di frammentazione. Utilizzando una combinazione di scansioni ioniche del prodotto dipendenti dai dati (DD), scansioni ioniche precursori (PrIS) e scansioni con perdita neutra (NLS), abbiamo applicato questo metodo agli estratti ricchi di TA della belladonna Datura stramonium e Datura metel. Questo metodo è rapido, sensibile ed è stato impiegato con successo sia per la dereplicazione preliminare di campioni complessi contenenti TA sia per la scoperta di un nuovo candidato per l'isolamento, la purificazione (e l'eventuale biodosaggio).
Sebbene le molecole completamente sintetiche siano diventate più importanti nella scoperta di farmaci negli ultimi decenni, quasi due terzi di tutti i farmaci approvati negli ultimi 39 anni sono prodotti naturali o ispirati a prodotti naturali,1,2 sottolineando la continua importanza della ricerca sui prodotti naturali. Gli alcaloidi, alcuni prodotti naturali contenenti azoto, sono particolarmente apprezzati per le loro proprietà medicinali. Alcaloidi tropanici (TA) contenenti il [3.2.1.]-sistema biciclico contenente azoto, sono prodotti principalmente da piante de....
ATTENZIONE: Consultare tutte le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) pertinenti prima di utilizzare le sostanze chimiche elencate.
1. Preparazione del campione
ATTENZIONE: L'azoto liquido può causare ustioni da criogeno. Utilizzare guanti criogenici e protezione per gli occhi in un'area ben ventilata. I campioni di piante contenenti alcaloidi possono essere irritanti per la pelle; Maneggiarli sempre con i guanti........
Per dimostrare l'efficacia del metodo, è stata analizzata come controllo positivo una miscela standard di TA (10 μg/mL ciascuno di una miscela di acetiltropina/acetilpseudotropina [monosostituita], 10 μg/mL di una miscela di due isomeri anisodamina [disostituiti], insieme a iosciamina [monosostituita], littorina [monosostituita] e scopolamina [trisostituita]) (Figura 2). Nella Figura 2A è mostrato un cromatogramma a scansion.......
Sebbene i parametri dello strumento forniti nel protocollo consentano prestazioni soddisfacenti, l'uso efficace di questo metodo può richiedere un'attenta attenzione o l'ottimizzazione di diversi passaggi critici. Sebbene il gradiente di solvente HPLC fornito nella fase 2.2 sia generalmente appropriato per gli alcaloidi tropanici, potrebbe essere necessario modificarlo a seconda del profilo alcaloide tropanico del campione o della specie vegetale esaminata. Il volume di iniezione del ca.......
Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di ricerca della facoltà (Northern Michigan University, assegnata a M.A.C.), da una borsa di ricerca universitaria (Northern Michigan University, assegnata a J.C) e dal Dipartimento di Chimica. Gli autori desiderano ringraziare John Berger (NMU) per l'assistenza nella preparazione dei tessuti vegetali, Hannah Hawkins (NMU) per la manutenzione della LC-MS e l'assistenza nella risoluzione dei problemi, e il Dr. Ryan Fornwald e i suoi studenti CH 495 (Natural Products Synthesis) per la loro preparazione della miscela di acetiltropina. Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Daniel Jone....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900667 | HPLC solvent |
Argon gas | AirGas | AR UHP300 | CID gas |
Formic acid, 99% for analysis | Thermo Scientific | AC270480010 | HPLC additive |
Guard column holder | Restek | 25812 | |
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus | Shimadzu | 228-65802-58 | HPLC column |
LCMS, Shimdazu LCMS-8045 | Shimadzu | 225-31800-44 | Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments |
Liquid nitrogen | AirGas | NI 180LT22 | |
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS | VWR | BDH 85800.400 | For making extraction solvent |
Microcentrifuge | VWR | 2400-37 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mortar | Fisher Scientific | FB961C | For grinding plant tissues |
Pestle | Fisher Scientific | FB961M | For grinding plant tissues |
Pipette 1000 mL | Gilson | F144059M | |
Pipette tip 1000 mL | Fisher scientific | 02-707-404 | |
Plant tissues | Various sources | N/A | Can be anything wild or cultivated |
Polypropylene conical tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-4 | |
Polystyrene cooler | ULINE | S-18312 | The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate |
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm | Restek | 9534315 | HPLC column |
Roc C18, 10 mm x 4 mm | Restek | 953450210 | Guard column |
Rocking shaker | Themo Scientific | 11-676-680 | |
Screw thread vial convenience kit (9 mm) | Fisher scientific | 13-622-190 | LCMS autosampler vials |
Syringe, 3 mL | Fisher Scientific | 03-377-27 | |
Syringe filter 0.45 µm | Avantor/VWR | 76479-008 | |
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry | JT Baker | 9831-03 | For making extraction solvent |
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900687-1L | HPLC solvent |
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