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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Presentiamo un metodo per l'annotazione e la classificazione rapida basata sulla spettrometria di massa (MS) e sulla spettrometria di massa (MS) degli alcaloidi tropanici, utile sia per la dereplicazione preliminare di campioni contenenti tropani che per la scoperta di nuovi alcaloidi per l'isolamento.

Abstract

Sebbene molti farmaci utilizzati oggi siano di origine sintetica, i prodotti naturali forniscono ancora una ricca fonte di nuova diversità chimica e bioattività e possono produrre spunti promettenti per malattie resistenti o emergenti. La sfida, tuttavia, è duplice: non solo i ricercatori devono trovare prodotti naturali e chiarire le loro strutture, ma devono anche identificare ciò che vale la pena isolare e analizzare (e ciò che è già noto - un processo noto come dereplicazione). Con l'avvento della moderna strumentazione analitica, il ritmo della scoperta e della dereplicazione dei prodotti naturali è accelerato. La cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) è diventata una tecnica particolarmente preziosa per identificare e classificare le strutture chimiche. Gli alcaloidi tropanici (TA) sono composti di origine vegetale di grande importanza medicinale e tossicologica. In questo studio, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di screening basato su LC-MS/MS utilizzando le molteplici configurazioni MS/MS disponibili su uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo (QQQ) per annotare e classificare le strutture TA in base ai loro distinti modelli di frammentazione. Utilizzando una combinazione di scansioni ioniche del prodotto dipendenti dai dati (DD), scansioni ioniche precursori (PrIS) e scansioni con perdita neutra (NLS), abbiamo applicato questo metodo agli estratti ricchi di TA della belladonna Datura stramonium e Datura metel. Questo metodo è rapido, sensibile ed è stato impiegato con successo sia per la dereplicazione preliminare di campioni complessi contenenti TA sia per la scoperta di un nuovo candidato per l'isolamento, la purificazione (e l'eventuale biodosaggio).

Introduction

Sebbene le molecole completamente sintetiche siano diventate più importanti nella scoperta di farmaci negli ultimi decenni, quasi due terzi di tutti i farmaci approvati negli ultimi 39 anni sono prodotti naturali o ispirati a prodotti naturali,1,2  sottolineando la continua importanza della ricerca sui prodotti naturali. Gli alcaloidi, alcuni prodotti naturali contenenti azoto, sono particolarmente apprezzati per le loro proprietà medicinali. Alcaloidi tropanici (TA) contenenti il [3.2.1.]-sistema biciclico contenente azoto, sono prodotti principalmente da piante de....

Protocol

ATTENZIONE: Consultare tutte le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) pertinenti prima di utilizzare le sostanze chimiche elencate.

1. Preparazione del campione

ATTENZIONE: L'azoto liquido può causare ustioni da criogeno. Utilizzare guanti criogenici e protezione per gli occhi in un'area ben ventilata. I campioni di piante contenenti alcaloidi possono essere irritanti per la pelle; Maneggiarli sempre con i guanti........

Representative Results

Per dimostrare l'efficacia del metodo, è stata analizzata come controllo positivo una miscela standard di TA (10 μg/mL ciascuno di una miscela di acetiltropina/acetilpseudotropina [monosostituita], 10 μg/mL di una miscela di due isomeri anisodamina [disostituiti], insieme a iosciamina [monosostituita], littorina [monosostituita] e scopolamina [trisostituita]) (Figura 2). Nella Figura 2A è mostrato un cromatogramma a scansion.......

Discussion

Sebbene i parametri dello strumento forniti nel protocollo consentano prestazioni soddisfacenti, l'uso efficace di questo metodo può richiedere un'attenta attenzione o l'ottimizzazione di diversi passaggi critici. Sebbene il gradiente di solvente HPLC fornito nella fase 2.2 sia generalmente appropriato per gli alcaloidi tropanici, potrebbe essere necessario modificarlo a seconda del profilo alcaloide tropanico del campione o della specie vegetale esaminata. Il volume di iniezione del ca.......

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di ricerca della facoltà (Northern Michigan University, assegnata a M.A.C.), da una borsa di ricerca universitaria (Northern Michigan University, assegnata a J.C) e dal Dipartimento di Chimica. Gli autori desiderano ringraziare John Berger (NMU) per l'assistenza nella preparazione dei tessuti vegetali, Hannah Hawkins (NMU) per la manutenzione della LC-MS e l'assistenza nella risoluzione dei problemi, e il Dr. Ryan Fornwald e i suoi studenti CH 495 (Natural Products Synthesis) per la loro preparazione della miscela di acetiltropina. Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Daniel Jone....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900667HPLC solvent
Argon gasAirGasAR UHP300CID gas
Formic acid, 99% for analysisThermo ScientificAC270480010HPLC additive
Guard column holderRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogenAirGasNI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400For making extraction solvent
Microcentrifuge VWR2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Mortar Fisher ScientificFB961CFor grinding plant tissues
PestleFisher ScientificFB961MFor grinding plant tissues
Pipette 1000 mLGilson F144059M
Pipette tip 1000 mLFisher scientific02-707-404
Plant tissuesVarious sourcesN/ACan be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Polystyrene coolerULINES-18312The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mmRestek9534315HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Guard column
Rocking shakerThemo Scientific11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)Fisher scientific13-622-190LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Syringe filter 0.45 µm Avantor/VWR76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometryJT Baker9831-03For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900687-1LHPLC solvent

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
  2. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products....

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