Sferoidi tridimensionali tridimensionali per cancro al pancreas desmoplastico in crescita da co-coltura

Summary

Il cancro al pancreas rimane uno dei tumori più difficili da trattare. Pertanto, è fondamentale che i modelli preclinici che valutano l'efficacia del trattamento siano riproducibili e clinicamente rilevanti. Questo protocollo descrive una semplice procedura di co-coltura per generare sferoidi desmoplastici riproducibili e clinicamente rilevanti.

Abstract

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è uno dei tumori più letali con un tasso di sopravvivenza a 5 anni del <12%. Il più grande ostacolo alla terapia è la densa matrice extracellulare desmoplastica (ECM) che circonda il tumore e riduce la vascolarizzazione, generalmente chiamata desmoplasia. Una varietà di combinazioni e formulazioni di farmaci sono state testate per trattare il cancro e, sebbene molte di esse mostrino successo preclinicamente, falliscono clinicamente. Diventa, quindi, importante avere a disposizione un modello clinicamente rilevante in grado di prevedere la risposta del tumore alla terapia. Questo modello è stato precedentemente convalidato contro tumori clinici resecati. Qui viene descritto un semplice protocollo per coltivare sferoidi desmoplastici tridimensionali (3D)-cocolture che possono generare naturalmente una robusta ECM e non richiedono alcuna matrice esterna o impalcatura per supportare la loro crescita.

In breve, le cellule stellate pancreatiche umane (HPaSteC) e le cellule PANC-1 vengono utilizzate per preparare una sospensione contenente le cellule in un rapporto 1:2, rispettivamente. Le celle sono placcate in una piastra a U a 96 pozzetti con attacco basso rivestito in poli-HEMA. La piastra viene centrifugata per consentire alle celle di formare un pellet iniziale. La piastra viene conservata nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ e il terreno viene sostituito ogni 3 giorni. Le piastre possono essere visualizzate a intervalli designati per misurare il volume degli sferoidi. Dopo 14 giorni di coltura, si formano sferoidi desmoplastici maturi (cioè un volume medio di 0,048 + 0,012 mm³ (451 μm x 462,84 μm)) che possono essere utilizzati per la valutazione della terapia sperimentale. I componenti maturi della ECM includono collagene-I, acido ialuronico, fibronectina e laminina.

Introduction

La prognosi infausta del cancro al pancreas è associata a una serie di motivi, tra cui la mancanza di biomarcatori facilmente rilevabili che portano a una diagnosi tardiva. Un altro motivo importante è lo spesso stroma che circonda il tessuto, che porta a una riduzione dell'afflusso di sangue. La deposizione di grandi quantità di matrice extracellulare (ECM), l'interazione cellula-cellula, le cellule endoteliali, varie cellule immunitarie, i periciti, i miofibroblasti proliferanti e la popolazione di fibroblasti e la presenza di cellule non neoplastiche (che insieme costituiscono la reazione desmoplastica)¹, co....

Protocol

1. Coltura cellulare 2D

1. Coltiva le cellule PANC-1 nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in condizioni sterili. Crescere fino al 70%-80% di confluenza prima dei passaggi e non utilizzare oltre il 20^° passaggio. Fare riferimento al processo descritto nel passaggio 4.2.1.
   NOTA: Come punto di riferimento, 1 x 10⁶ cellule in 20 mL di terreno richiedono circa 2-3 giorni per raggiunger.......

Discussion

La durata e i rapporti cellulari scelti per far crescere gli sferoidi si basavano su studi come riportato in precedenza³⁸. Quando si tenta di ottimizzare questi studi sostituendo le cellule NIH3T3 con le cellule HPaSteC, si è scoperto che i volumi degli sferoidi e i pattern di apoptosi assomigliano molto ai parametri ottimizzati riportati (riportati per PANC-1: NIH3T3:: 120:12) quando i rapporti PANC-1: HPaSteC erano a 120: 60. Sebbene questi studi misurino l'apo.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer inverted microscope	Carl Zeiss	0450-354
Cellometer Auto T4	Nexcelom Bioscience LLC	Auto-T4
DMEM, powder, high glucose	Gibco	12100046
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568	Abcam	ab175712
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH3091003HI
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175145
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC)	ScienCell	3830
Microscope Nikon	Nikon	Eclipse Ts 100
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates	Thermo Scientific	12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser	Olympus	N/A	Discontinued product
PANC-1	ATCC	CRL-1469
Poly-HEMA	Sigma	P3932
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies	Abcam	ab11575
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies	Abcam	ab34710
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies	Abcam	ab53842
Stellate cell media complete kit	ScienCell	5301
Trypsin	MP Biomedicals, LLC	153571	Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v
Trypsin Neutralization Solution (TNS)	ScienCell	103