Cultivo de esferóides de câncer de pâncreas tridimensionais desmoplásicos de co-cultura

Summary

O câncer de pâncreas continua sendo um dos cânceres mais difíceis de tratar. Portanto, é fundamental que os modelos pré-clínicos que avaliam a eficácia do tratamento sejam reprodutíveis e clinicamente relevantes. Este protocolo descreve um procedimento simples de co-cultura para gerar esferoides desmoplásicos reprodutíveis e clinicamente relevantes.

Abstract

O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é um dos cânceres mais mortais, com uma taxa de sobrevida de 5 anos de <12%. A maior barreira à terapia é a densa matriz extracelular desmoplásica (MEC) que envolve o tumor e reduz a vascularização, geralmente denominada desmoplasia. Uma variedade de combinações e formulações de medicamentos foram testadas para tratar o câncer e, embora muitas delas mostrem sucesso pré-clínico, elas falham clinicamente. Portanto, torna-se importante ter um modelo clinicamente relevante disponível que possa prever a resposta do tumor à terapia. Este modelo foi previamente validado contra tumores clínicos ressecados. Aqui, é descrito um protocolo simples para o cultivo de esferoides de cocultura tridimensional (3D) desmoplásica que pode gerar naturalmente um ECM robusto e não requer nenhuma fonte de matriz externa ou andaime para suportar seu crescimento.

Resumidamente, células estreladas pancreáticas humanas (HPaSteC) e células PANC-1 são usadas para preparar uma suspensão contendo as células na proporção de 1:2, respectivamente. As células são revestidas em uma placa de poço em U de 96 poços revestida com poli-HEMA. A placa é centrifugada para permitir que as células formem um pellet inicial. A placa é armazenada na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ e o meio é substituído a cada 3 dias. As placas podem ser visualizadas em intervalos designados para medir o volume esferoide. Após 14 dias de cultura, esferoides desmoplásicos maduros são formados (ou seja, volume médio de 0,048 + 0,012 mm³ (451 μm x 462,84 μm)) e podem ser utilizados para avaliação da terapia experimental. Os componentes maduros da MEC incluem colágeno-I, ácido hialurônico, fibronectina e laminina.

Introduction

O mau prognóstico do câncer de pâncreas está associado a uma variedade de razões, entre as quais a falta de biomarcadores facilmente detectáveis, levando a uma detecção tardia. Outra razão importante é o estroma espesso ao redor do tecido, o que leva à redução do suprimento de sangue. A deposição de grandes quantidades de matriz extracelular (MEC), interação célula-célula, células endoteliais, várias células imunes, pericitos, miofibroblastos proliferantes e população de fibroblastos, e a presença de células não neoplásicas (juntas constituindo a reação desmoplásica)¹, constituem o estroma espesso responsável p....

Protocol

1. Cultura de células 2D

1. Cultive células PANC-1 no meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em condições estéreis. Cresça até 70%-80% de confluência antes das passagens e não use além da^20ª passagem. Consulte o processo descrito na etapa 4.2.1.
   NOTA: Como ponto de referência, 1 x 10⁶ células em 20 mL de meio precisam de cerca de 2-3 dias para atingir 70-80% de confluênci.......

Discussion

A duração e as proporções de células escolhidas para o crescimento dos esferoides foram baseadas em estudos relatados anteriormente³⁸. Ao tentar otimizar esses estudos substituindo células NIH3T3 por células HPaSteC, descobriu-se que os volumes esferóides e os padrões de apoptose se assemelham muito aos parâmetros otimizados relatados (relatados para PANC-1: NIH3T3:: 120:12) quando as proporções PANC-1: HPaSteC estavam em 120: 60. Embora esses estudos .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer inverted microscope	Carl Zeiss	0450-354
Cellometer Auto T4	Nexcelom Bioscience LLC	Auto-T4
DMEM, powder, high glucose	Gibco	12100046
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568	Abcam	ab175712
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH3091003HI
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175145
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC)	ScienCell	3830
Microscope Nikon	Nikon	Eclipse Ts 100
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates	Thermo Scientific	12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser	Olympus	N/A	Discontinued product
PANC-1	ATCC	CRL-1469
Poly-HEMA	Sigma	P3932
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies	Abcam	ab11575
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies	Abcam	ab34710
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies	Abcam	ab53842
Stellate cell media complete kit	ScienCell	5301
Trypsin	MP Biomedicals, LLC	153571	Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v
Trypsin Neutralization Solution (TNS)	ScienCell	103