Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

Abstract

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) נמצאת בשימוש נרחב כדי להקל על הרכבה מלמטה למעלה של תאים סינתטיים. הוא משמש כמארח של מכונות הליבה של הדוגמה המרכזית, ועומד כשלדה אופטימלית לאינטגרציה והרכבה של מערכות חיקוי תאיות מלאכותיות מגוונות. למרות השימוש התכוף בייצור תאים סינתטיים, הקמת מערכת CFPS מותאמת וחזקה ליישום ספציפי נותרה אתגר לא טריוויאלי. במאמר שיטות זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף עבור מערכת CFPS, המשמשת באופן שגרתי בבניית תאים סינתטיים. פרוטוקול זה מקיף שלבים מרכזיים בהכנת מערכת CFPS, כולל תמצית התא, הכנת תבנית ואופטימיזציה שגרתית של ביטוי באמצעות חלבון מדווח פלואורסצנטי. בנוסף, אנו מציגים תוצאות מייצגות על ידי עטיפת מערכת CFPS בתוך מיקרו-תאים שונים, כגון טיפות חד-שכבתיות, שלפוחיות תחליב כפול ותאים הממוקמים על גבי דו-שכבות שומנים נתמכות. לבסוף, אנו מבהירים את השלבים והתנאים הקריטיים הדרושים להרכבה מוצלחת של מערכות CFPS אלה בסביבות נפרדות. אנו מצפים כי גישתנו תאפשר ביסוס שיטות עבודה טובות בין מעבדות שונות בתוך קהילת התאים הסינתטיים המתרחבת ללא הרף, ובכך תאיץ את ההתקדמות בתחום התפתחות התאים הסינתטיים.

Introduction

הסינתזה של תאים סינתטיים או מלאכותיים התפתחה כתחום בולט ביותר של מחקר בין-תחומי, ומשכה עניין רב מצד מדענים בתחומי הביולוגיה הסינתטית, הכימיה והביופיזיקה. מדענים אלה מאוחדים על ידי המטרה המשותפת של בניית תא חי מינימלי 1,2,3. הצמיחה המהירה של תחום זה באה במקביל להתקדמות משמעותית בטכנולוגיות קריטיות, כגון מניפולציה רקומביננטית של דנ"א4, חומרים ביומימטיים5, וטכניקות מיקרו-פבריקציה למידור6, כולל שיטת סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS)7. מערכות CFPS מקיפות א....

Protocol

1. הכנת התמצית

  1. פזרו את זן E. coli BL21 (DE3) ממלאי גליצרול על צלחת אגר Luria Bertani (LB) ודגרו במשך 15 שעות לפחות בטמפרטורה של 37°C.
  2. הכינו טרום גידול לילה על ידי חיסון מושבה אחת מצלחת LB שזה עתה הוכנה לבקבוק 50 מ"ל של Luria Bertani (LB) בינוני.
  3. לחסן 5 מ"ל של preculture לתוך 500 מ"ל ?.......

Representative Results

עבור כל אצווה חדשה של תמצית תאים ו- T7 RNA פולימראז, מומלץ לבצע סינון בסיסי של ריכוזי Mg2+ ו- K+ כדי להבטיח את הביצועים האופטימליים של מערכת CFPS. הפלואורסצנטיות של GFP של תיקיות העל יכולה לשמש אינדיקטור לתשואה הכוללת של מערכת CFPS בתנאים משתנים, כפי שמודגם באי.......

Discussion

כתב יד זה מתאר מערכת שונה של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) המיועדת לשימוש במיקרו-תאים שונים על פני פלטפורמות תאים סינתטיים, כולל טיפות מים בשמן, GUV ו- SLBs. השתמשנו בזן המארח הסטנדרטי של E. coli recombinant protein expression host, BL21(DE3), כתמצית המקור לבניית מערכות תאים סינתטיים הממוקדות בחל?.......

Acknowledgements

מ 'י' מכיר במימון מתוכנית המחקר והחדשנות לתארים מתקדמים של מחוז ג'יאנגסו, סין (מענק מס '. KYCX22_2803). L.K. אסירת תודה על התמיכה במחקר מדעי הטבע של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו בסין, סין (מענק מס '17KJB180003), הקרן למדעי הטבע של אוניברסיטת ג'יאנגסו נורמל, סין (מענק מס '17XLR037), פיתוח תוכנית אקדמית מועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו, סין, ותוכנית הפרופסור המיוחדת של ג'יאנגסו, סין.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)Avanti840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichA9501
50 mL tubesEppendorfEppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxideSigma-Aldrich516813
AcetateSigma-AldrichA6283
Agar powderSigma-Aldrich05040
AlaninSigma-AldrichA4349
Amicon Stirred CellsMerckMilliporeUFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)Sigma-AldrichA7262
ArgininSigma-AldrichA4474
AsparaginSigma-AldrichA0884
AspartatSigma-AldrichA5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
Baffled Erlenmeyer flaskShuniu250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)Roche10711454001
CentrifugetubeEppendorfEppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rackEppendorf0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging systemUvitecAlliance Q9 Advanced
ChloroformSigma-Aldrich288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)ZEISSLSM 780
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10283
CoverslipThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)Roche10127566001
Creatine phosphate (CP)Sigma-Aldrich10621714001
Culture dishHuanqiu90 mm
CysteinSigma-AldrichC5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)aladdinC101487
Dialysis membraneSpectrumStandard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOmega Bio-TekD6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature CultivatorYiheng instrumentDHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)Biosharp1100027
Fluorescent plate readerBioTekSynergy 2
Fluorinated oilSuzhou CChip scientific instrument2%HFE7500
Folinic acidSigma-Aldrich47612
French PressG.HeinemannHTU-DIGI-Press
GlucoseSigma-AldrichG7021
GlutamatSigma-AldrichG5667
GlutaminSigma-AldrichG5792
GlycerolSigma-AldrichG5516
GlycinSigma-AldrichG7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)Roche10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinSigma-AldrichH6034
IsoleucinSigma-AldrichI5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinSigma-AldrichL6914
LysinSigma-AldrichL5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 )Sigma-AldrichM5661
Magnesium chloride(MgCl2)Sigma-AldrichM2670
MethioninSigma-AldrichM8439
MicrocentrifugeEppendorf5424 R
Mineral oilSigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
Multipurpose CentrifugeEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay MeasurementsIMPLENNanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene platesSigma-AldrichP8616
PCR Thermal CyclerEppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
PhenylalaninSigma-AldrichP8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)Sigma-Aldrich89510
Potassium Acetate(KOAc)Sigma-AldrichP5708
Potassium chloride(KCl)Sigma-AldrichP9541
Potassium glutamate (K-glutamate)Sigma-AldrichG1501
Potassium hydroxide(KOH)Sigma-Aldrich221473
ProlinSigma-AldrichP8865
Pyruvate kinase (PK)Sigma-AldrichP9136
SerinSigma-AldrichS4311
ShakerZhichushakersZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)Sigma-AldrichS5886
Sodium hydroxide(NaOH)Sigma-AldrichS5881
SucrosealaddinS112226
Sulfuric acidSigma-Aldrich339741
Syringe FiltersJinteng0.45 μm
Test tubeShuniu20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
TryptoneSigma-AldrichT7293
TryptophanSigma-AldrichT8941
TyrosinSigma-AldrichT8566
UTP Trisodium salt (UTP)aladdinU100365
Vacuum Pump with Circulated Water SystemZhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.LtdSHB-figure-materials-10350
ValinSigma-AldrichV4638
Vortex MixersKylin-BellVortex QL-861
Water purification systemMerckMilliporeDirect ultrapure water (Type 1)
Yeast extractSigma-Aldrich70161
β-mercaptoethanolSigma-Aldrich444203

References

  1. Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
  2. Cho, E., Lu, Y. Compartmentaliz....

Explore More Articles

CFPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved