מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

Abstract

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) נמצאת בשימוש נרחב כדי להקל על הרכבה מלמטה למעלה של תאים סינתטיים. הוא משמש כמארח של מכונות הליבה של הדוגמה המרכזית, ועומד כשלדה אופטימלית לאינטגרציה והרכבה של מערכות חיקוי תאיות מלאכותיות מגוונות. למרות השימוש התכוף בייצור תאים סינתטיים, הקמת מערכת CFPS מותאמת וחזקה ליישום ספציפי נותרה אתגר לא טריוויאלי. במאמר שיטות זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף עבור מערכת CFPS, המשמשת באופן שגרתי בבניית תאים סינתטיים. פרוטוקול זה מקיף שלבים מרכזיים בהכנת מערכת CFPS, כולל תמצית התא, הכנת תבנית ואופטימיזציה שגרתית של ביטוי באמצעות חלבון מדווח פלואורסצנטי. בנוסף, אנו מציגים תוצאות מייצגות על ידי עטיפת מערכת CFPS בתוך מיקרו-תאים שונים, כגון טיפות חד-שכבתיות, שלפוחיות תחליב כפול ותאים הממוקמים על גבי דו-שכבות שומנים נתמכות. לבסוף, אנו מבהירים את השלבים והתנאים הקריטיים הדרושים להרכבה מוצלחת של מערכות CFPS אלה בסביבות נפרדות. אנו מצפים כי גישתנו תאפשר ביסוס שיטות עבודה טובות בין מעבדות שונות בתוך קהילת התאים הסינתטיים המתרחבת ללא הרף, ובכך תאיץ את ההתקדמות בתחום התפתחות התאים הסינתטיים.

Introduction

הסינתזה של תאים סינתטיים או מלאכותיים התפתחה כתחום בולט ביותר של מחקר בין-תחומי, ומשכה עניין רב מצד מדענים בתחומי הביולוגיה הסינתטית, הכימיה והביופיזיקה. מדענים אלה מאוחדים על ידי המטרה המשותפת של בניית תא חי מינימלי ^1,2,3. הצמיחה המהירה של תחום זה באה במקביל להתקדמות משמעותית בטכנולוגיות קריטיות, כגון מניפולציה רקומביננטית של דנ"א⁴, חומרים ביומימטיים⁵, וטכניקות מיקרו-פבריקציה למידור⁶, כולל שיטת סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS)⁷. מערכות CFPS מקיפות א....

Protocol

1. הכנת התמצית

1. פזרו את זן E. coli BL21 (DE3) ממלאי גליצרול על צלחת אגר Luria Bertani (LB) ודגרו במשך 15 שעות לפחות בטמפרטורה של 37°C.
2. הכינו טרום גידול לילה על ידי חיסון מושבה אחת מצלחת LB שזה עתה הוכנה לבקבוק 50 מ"ל של Luria Bertani (LB) בינוני.
3. לחסן 5 מ"ל של preculture לתוך 500 מ"ל ?.......

Discussion

כתב יד זה מתאר מערכת שונה של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) המיועדת לשימוש במיקרו-תאים שונים על פני פלטפורמות תאים סינתטיים, כולל טיפות מים בשמן, GUV ו- SLBs. השתמשנו בזן המארח הסטנדרטי של E. coli recombinant protein expression host, BL21(DE3), כתמצית המקור לבניית מערכות תאים סינתטיים הממוקדות בחל?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)	Avanti	850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)	Avanti	840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501
50 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	516813
Acetate	Sigma-Aldrich	A6283
Agar powder	Sigma-Aldrich	05040
Alanin	Sigma-Aldrich	A4349
Amicon Stirred Cells	MerckMillipore	UFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)	Sigma-Aldrich	A7262
Arginin	Sigma-Aldrich	A4474
Asparagin	Sigma-Aldrich	A0884
Aspartat	Sigma-Aldrich	A5474
ATP	Roche	11140965001
Atto 488 DOPE	Sigma-Aldrich	67335
Atto 647N DOPE	Sigma-Aldrich	42247
Baffled Erlenmeyer flask	Shuniu	250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)	Roche	10711454001
Centrifugetube	Eppendorf	Eppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rack	Eppendorf	0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging system	Uvitec	Alliance Q9 Advanced
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)	ZEISS	LSM 780
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10283
Coverslip	Thermo Scientific	Menzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)	Roche	10127566001
Creatine phosphate (CP)	Sigma-Aldrich	10621714001
Culture dish	Huanqiu	90 mm
Cystein	Sigma-Aldrich	C5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)	aladdin	C101487
Dialysis membrane	Spectrum	Standard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit	Omega Bio-Tek	D6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature Cultivator	Yiheng instrument	DHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)	Biosharp	1100027
Fluorescent plate reader	BioTek	Synergy 2
Fluorinated oil	Suzhou CChip scientific instrument	2%HFE7500
Folinic acid	Sigma-Aldrich	47612
French Press	G.Heinemann	HTU-DIGI-Press
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Glutamat	Sigma-Aldrich	G5667
Glutamin	Sigma-Aldrich	G5792
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycin	Sigma-Aldrich	G7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)	Roche	10106399001
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HiPrep Q FF 16/10	Cytiva	28936543
Histidin	Sigma-Aldrich	H6034
Isoleucin	Sigma-Aldrich	I5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P8281
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Leucin	Sigma-Aldrich	L6914
Lysin	Sigma-Aldrich	L5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 )	Sigma-Aldrich	M5661
Magnesium chloride(MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670
Methionin	Sigma-Aldrich	M8439
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 R
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems	Bio-Rad	1645050
Multipurpose Centrifuge	Eppendorf	5810 R
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay Measurements	IMPLEN	NanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNA	MACHEREY-NAGEL	740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene plates	Sigma-Aldrich	P8616
PCR Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler nexus
Peptone	Sigma-Aldrich	83059
Phenylalanin	Sigma-Aldrich	P8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)	GLPBIO	GC44635
PMSF	Sigma-Aldrich	PMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)	Sigma-Aldrich	89510
Potassium Acetate(KOAc)	Sigma-Aldrich	P5708
Potassium chloride(KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium glutamate (K-glutamate)	Sigma-Aldrich	G1501
Potassium hydroxide(KOH)	Sigma-Aldrich	221473
Prolin	Sigma-Aldrich	P8865
Pyruvate kinase (PK)	Sigma-Aldrich	P9136
Serin	Sigma-Aldrich	S4311
Shaker	Zhichushakers	ZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	aladdin	S112226
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741
Syringe Filters	Jinteng	0.45 μm
Test tube	Shuniu	20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	#1610175
ThermoMixer	Eppendorf	ThermoMixer C
Threonin	Sigma-Aldrich	T8441
Tris base	Sigma-Aldrich	V900483
tRNA	Roche	10109550001
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941
Tyrosin	Sigma-Aldrich	T8566
UTP Trisodium salt (UTP)	aladdin	U100365
Vacuum Pump with Circulated Water System	Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd	SHB-
Valin	Sigma-Aldrich	V4638
Vortex Mixers	Kylin-Bell	Vortex QL-861
Water purification system	MerckMillipore	Direct ultrapure water (Type 1)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	444203