A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.
מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) נמצאת בשימוש נרחב כדי להקל על הרכבה מלמטה למעלה של תאים סינתטיים. הוא משמש כמארח של מכונות הליבה של הדוגמה המרכזית, ועומד כשלדה אופטימלית לאינטגרציה והרכבה של מערכות חיקוי תאיות מלאכותיות מגוונות. למרות השימוש התכוף בייצור תאים סינתטיים, הקמת מערכת CFPS מותאמת וחזקה ליישום ספציפי נותרה אתגר לא טריוויאלי. במאמר שיטות זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף עבור מערכת CFPS, המשמשת באופן שגרתי בבניית תאים סינתטיים. פרוטוקול זה מקיף שלבים מרכזיים בהכנת מערכת CFPS, כולל תמצית התא, הכנת תבנית ואופטימיזציה שגרתית של ביטוי באמצעות חלבון מדווח פלואורסצנטי. בנוסף, אנו מציגים תוצאות מייצגות על ידי עטיפת מערכת CFPS בתוך מיקרו-תאים שונים, כגון טיפות חד-שכבתיות, שלפוחיות תחליב כפול ותאים הממוקמים על גבי דו-שכבות שומנים נתמכות. לבסוף, אנו מבהירים את השלבים והתנאים הקריטיים הדרושים להרכבה מוצלחת של מערכות CFPS אלה בסביבות נפרדות. אנו מצפים כי גישתנו תאפשר ביסוס שיטות עבודה טובות בין מעבדות שונות בתוך קהילת התאים הסינתטיים המתרחבת ללא הרף, ובכך תאיץ את ההתקדמות בתחום התפתחות התאים הסינתטיים.
הסינתזה של תאים סינתטיים או מלאכותיים התפתחה כתחום בולט ביותר של מחקר בין-תחומי, ומשכה עניין רב מצד מדענים בתחומי הביולוגיה הסינתטית, הכימיה והביופיזיקה. מדענים אלה מאוחדים על ידי המטרה המשותפת של בניית תא חי מינימלי 1,2,3. הצמיחה המהירה של תחום זה באה במקביל להתקדמות משמעותית בטכנולוגיות קריטיות, כגון מניפולציה רקומביננטית של דנ"א4, חומרים ביומימטיים5, וטכניקות מיקרו-פבריקציה למידור6, כולל שיטת סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS)7. מערכות CFPS מקיפות א....
1. הכנת התמצית
עבור כל אצווה חדשה של תמצית תאים ו- T7 RNA פולימראז, מומלץ לבצע סינון בסיסי של ריכוזי Mg2+ ו- K+ כדי להבטיח את הביצועים האופטימליים של מערכת CFPS. הפלואורסצנטיות של GFP של תיקיות העל יכולה לשמש אינדיקטור לתשואה הכוללת של מערכת CFPS בתנאים משתנים, כפי שמודגם באי.......
כתב יד זה מתאר מערכת שונה של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) המיועדת לשימוש במיקרו-תאים שונים על פני פלטפורמות תאים סינתטיים, כולל טיפות מים בשמן, GUV ו- SLBs. השתמשנו בזן המארח הסטנדרטי של E. coli recombinant protein expression host, BL21(DE3), כתמצית המקור לבניית מערכות תאים סינתטיים הממוקדות בחל?.......
מ 'י' מכיר במימון מתוכנית המחקר והחדשנות לתארים מתקדמים של מחוז ג'יאנגסו, סין (מענק מס '. KYCX22_2803). L.K. אסירת תודה על התמיכה במחקר מדעי הטבע של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו בסין, סין (מענק מס '17KJB180003), הקרן למדעי הטבע של אוניברסיטת ג'יאנגסו נורמל, סין (מענק מס '17XLR037), פיתוח תוכנית אקדמית מועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו, סין, ותוכנית הפרופסור המיוחדת של ג'יאנגסו, סין.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC) | Avanti | 850375P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS) | Avanti | 840035P | |
1,4 dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457P | |
3,5-cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
50 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf Tubes BioBased | |
50% hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 516813 | |
Acetate | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Agar powder | Sigma-Aldrich | 05040 | |
Alanin | Sigma-Aldrich | A4349 | |
Amicon Stirred Cells | MerckMillipore | UFSC05001 | |
Ammonium acetate (NH4OAc) | Sigma-Aldrich | A7262 | |
Arginin | Sigma-Aldrich | A4474 | |
Asparagin | Sigma-Aldrich | A0884 | |
Aspartat | Sigma-Aldrich | A5474 | |
ATP | Roche | 11140965001 | |
Atto 488 DOPE | Sigma-Aldrich | 67335 | |
Atto 647N DOPE | Sigma-Aldrich | 42247 | |
Baffled Erlenmeyer flask | Shuniu | 250 mL, 1000mL | |
Bovine Serum Albumin(BSA) | Roche | 10711454001 | |
Centrifugetube | Eppendorf | Eppendorf Tubes 3810X | |
Centrifugetube rack | Eppendorf | 0030119819 | |
Chemiluminescence and epifluorescence imaging system | Uvitec | Alliance Q9 Advanced | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM) | ZEISS | LSM 780 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
Coverslip | Thermo Scientific | Menzel BB02400500A113MNZ0 | |
creatine kinase (CK) | Roche | 10127566001 | |
Creatine phosphate (CP) | Sigma-Aldrich | 10621714001 | |
Culture dish | Huanqiu | 90 mm | |
Cystein | Sigma-Aldrich | C5360 | |
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP) | aladdin | C101487 | |
Dialysis membrane | Spectrum | Standard RC Tubing MWCO: 12-14 kD | |
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | Omega Bio-Tek | D6492-01 | |
Electro-Heating Standing-Temperature Cultivator | Yiheng instrument | DHP-9602 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) | Biosharp | 1100027 | |
Fluorescent plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
Fluorinated oil | Suzhou CChip scientific instrument | 2%HFE7500 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich | 47612 | |
French Press | G.Heinemann | HTU-DIGI-Press | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glutamat | Sigma-Aldrich | G5667 | |
Glutamin | Sigma-Aldrich | G5792 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Glycin | Sigma-Aldrich | G7126 | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP) | Roche | 10106399001 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HiPrep Q FF 16/10 | Cytiva | 28936543 | |
Histidin | Sigma-Aldrich | H6034 | |
Isoleucin | Sigma-Aldrich | I5281 | |
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Leucin | Sigma-Aldrich | L6914 | |
Lysin | Sigma-Aldrich | L5501 | |
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 ) | Sigma-Aldrich | M5661 | |
Magnesium chloride(MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Methionin | Sigma-Aldrich | M8439 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems | Bio-Rad | 1645050 | |
Multipurpose Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Nucleic Acid & Protein UV-Assay Measurements | IMPLEN | NanoPhotometer N60 | |
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNA | MACHEREY-NAGEL | 740414.5 | |
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene plates | Sigma-Aldrich | P8616 | |
PCR Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler nexus | |
Peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
Phenylalanin | Sigma-Aldrich | P8740 | |
Phosphoenolpyruvat (PEP) | GLPBIO | GC44635 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | PMSF-RO | |
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000) | Sigma-Aldrich | 89510 | |
Potassium Acetate(KOAc) | Sigma-Aldrich | P5708 | |
Potassium chloride(KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Potassium glutamate (K-glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
Potassium hydroxide(KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | |
Prolin | Sigma-Aldrich | P8865 | |
Pyruvate kinase (PK) | Sigma-Aldrich | P9136 | |
Serin | Sigma-Aldrich | S4311 | |
Shaker | Zhichushakers | ZQZY-AF8 | |
Sodium chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Sucrose | aladdin | S112226 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
Syringe Filters | Jinteng | 0.45 μm | |
Test tube | Shuniu | 20 mL | |
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | #1610175 | |
ThermoMixer | Eppendorf | ThermoMixer C | |
Threonin | Sigma-Aldrich | T8441 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | V900483 | |
tRNA | Roche | 10109550001 | |
Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941 | |
Tyrosin | Sigma-Aldrich | T8566 | |
UTP Trisodium salt (UTP) | aladdin | U100365 | |
Vacuum Pump with Circulated Water System | Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd | SHB- | |
Valin | Sigma-Aldrich | V4638 | |
Vortex Mixers | Kylin-Bell | Vortex QL-861 | |
Water purification system | MerckMillipore | Direct ultrapure water (Type 1) | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 444203 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved