בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים אחרים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר ומיקרומטר.

Abstract

אנו מציגים שיטה לשלב בשלפוחיות רשתות חלבונים מורכבות, המערבות חלבוני ממברנה אינטגרליים, אנזימים וחיישנים מבוססי פלואורסצנטיות, תוך שימוש ברכיבים מטוהרים. שיטה זו רלוונטית לתכנון ובנייה של ביוריאקטורים ולחקר רשתות תגובה מטבולית מורכבות מחוץ לשיווי משקל. אנו מתחילים בבנייה מחדש של חלבוני ממברנה (מרובים) לשלפוחיות חד-למלריות גדולות (LUVs) על פי פרוטוקול שפותח בעבר. לאחר מכן אנו עוטפים תערובת של אנזימים מטוהרים, מטבוליטים וחיישנים מבוססי פלואורסצנטיות (חלבונים פלואורסצנטיים או צבעים) באמצעות הקפאה-הפשרה-אקסטרוזיה ומסירים רכיבים שאינם משולבים באמצעות צנטריפוגה ו/או כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. ביצועי הרשתות המטבוליות נמדדים בזמן אמת על ידי ניטור יחס ATP/ADP, ריכוז מטבוליטים, pH פנימי או פרמטרים אחרים על ידי קריאת פלואורסצנטיות. ניתן להמיר את השלפוחיות המכילות חלבון ממברנה בקוטר 100-400 ננומטר לשלפוחיות ענקיות (GUV), באמצעות הליכים קיימים אך מותאמים. הגישה מאפשרת הכללת רכיבים מסיסים (אנזימים, מטבוליטים, חיישנים) בשלפוחיות בגודל מיקרומטרי, ובכך להגדיל את נפח הביוריאקטורים בסדרי גודל. הרשת המטבולית המכילה GUV לכודים בהתקנים מיקרופלואידים לניתוח במיקרוסקופ אופטי.

Introduction

תחום הביולוגיה הסינתטית מלמטה למעלה מתמקד בבניית תאים (מינימליים) ^1,2 וביוריאקטורים מטבוליים למטרות ביוטכנולוגיות ^3,4 או ביו-רפואיות ^5,6,7,8. בניית תאים סינתטיים מספקת פלטפורמה ייחודית המאפשרת לחוקרים לחקור חלבונים (ממברנה) בתנאים מוגדרים היטב המחקים את אלה של סביבות טבעיות, ומאפשרת גילוי תכונות מתפתחות ופונקציות ביוכימיות נסתרות של חלבונים ורשתות תגובה⁹. כצעד ביניים לקראת תא סינתטי המתפקד באו....

Protocol

1. הכנה כללית

1. כימיקלים
   1. יש להמיס שומנים (בצורת אבקה) ל-25 מ"ג/מ"ל ב-CHCl₃ להכנת ליפוזומים מוכנים.
      הערה: עדיף להכין מלאי שומנים טריים, אך ניתן לאחסן את תמיסות המלאי גם ב -20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. עבודה עם שומנים בצורת אבקה מדויקת יותר מאשר שימוש בליפידים שכבר מסיסים .......

Discussion

אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של חלבון (ממברנה) המכיל שלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטרי (proteoLUVs), והמרה של proteoLUVs לשלפוחיות ענקיות-חד-לאומיות (proteoGUVs). הפרוטוקול צריך להיות ישים להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה אחרים 13,19,30,40 ולאנקפסולציה של רשתות מטבוליות אחרות מלבד מסלולי פירוק L-ארגינין וסינתזה ש.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	-
D(+)-Sucrose	Formedium	-
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g