Costruzione di reti metaboliche fuori equilibrio in vescicole di dimensioni nanometriche e micrometriche

Summary

Presentiamo un protocollo per la ricostituzione delle proteine di membrana e l'incapsulamento di enzimi e altri componenti idrosolubili in vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche e micrometriche.

Abstract

Presentiamo un metodo per incorporare nelle vescicole reti proteiche complesse, che coinvolgono proteine di membrana integrali, enzimi e sensori basati sulla fluorescenza, utilizzando componenti purificati. Questo metodo è rilevante per la progettazione e la costruzione di bioreattori e lo studio di complesse reti di reazioni metaboliche fuori equilibrio. Iniziamo ricostituendo (multiple) proteine di membrana in grandi vescicole unilamellari (LUV) secondo un protocollo precedentemente sviluppato. Quindi incapsulamo una miscela di enzimi purificati, metaboliti e sensori basati sulla fluorescenza (proteine fluorescenti o coloranti) tramite liofilizzazione-scongelamento-estrusione e rimuoviamo i componenti non incorporati mediante centrifugazione e/o cromatografia ad esclusione dimensionale. Le prestazioni delle reti metaboliche vengono misurate in tempo reale monitorando il rapporto ATP/ADP, la concentrazione di metaboliti, il pH interno o altri parametri mediante lettura a fluorescenza. Le nostre vescicole contenenti proteine di membrana con diametro di 100-400 nm possono essere convertite in vescicole unilamellari giganti (GUV), utilizzando le procedure esistenti ma ottimizzate. L'approccio consente l'inclusione di componenti solubili (enzimi, metaboliti, sensori) in vescicole di dimensioni micrometriche, aumentando così il volume dei bioreattori di ordini di grandezza. La rete metabolica contenente i GUV è intrappolata in dispositivi microfluidici per l'analisi mediante microscopia ottica.

Introduction

Il campo della biologia sintetica bottom-up si concentra sulla costruzione di cellule (minime) ^1,2 e bioreattori metabolici per scopi biotecnologici ^3,4 o biomedici 5,6,7,8. La costruzione di cellule sintetiche fornisce una piattaforma unica che consente ai ricercatori di studiare le proteine (di membrana) in condizioni ben definite che imitano quelle degli ambienti nativi, consentendo la scoperta di proprietà emerge....

Protocol

1. Preparazione generale

1. Prodotti chimici
   1. Sciogliere i lipidi (in polvere) a 25 mg/mL in CHCl₃ per produrre liposomi preformati.
      NOTA: È preferibile preparare brodi lipidici freschi, ma le soluzioni madre possono essere conservate anche a -20 °C per alcune settimane. Lavorare con i lipidi in polvere è più accurato rispetto all'utilizzo di lipidi già solubilizzati in CHCl₃. CHCl₃ deve essere maneggiato utilizzando pipette e/o siringhe di vetro e co.......

Discussion

Presentiamo un protocollo per la sintesi di proteine (di membrana) contenenti vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche (proteoLUVs), e la conversione di proteoLUV in vescicole giganti-unilamellari (proteoGUVs). Il protocollo dovrebbe essere applicabile per la ricostituzione di altre proteine di membrana 13,19,30,40 e l'incapsulamento di reti metaboliche diverse dalle vie di degradazione della L-arginina e di sintesi del glicerolo 3-fosfato qui presentate.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	-
D(+)-Sucrose	Formedium	-
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g