Construção de redes metabólicas fora de equilíbrio em vesículas nanométricas e micrométricas

Summary

Apresentamos um protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e outros componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico e micrométrico.

Abstract

Apresentamos um método para incorporar em vesículas redes complexas de proteínas, envolvendo proteínas integrais de membrana, enzimas e sensores baseados em fluorescência, usando componentes purificados. Este método é relevante para o projeto e construção de biorreatores e o estudo de redes complexas de reações metabólicas fora de equilíbrio. Começamos reconstituindo (múltiplas) proteínas de membrana em grandes vesículas unilamelares (LUVs) de acordo com um protocolo desenvolvido anteriormente. Em seguida, encapsulamos uma mistura de enzimas purificadas, metabólitos e sensores baseados em fluorescência (proteínas fluorescentes ou corantes) por meio de congelamento-descongelamento-extrusão e removemos componentes não incorporados por centrifugação e/ou cromatografia de exclusão de tamanho. O desempenho das redes metabólicas é medido em tempo real monitorando a relação ATP / ADP, concentração de metabólitos, pH interno ou outros parâmetros por leitura de fluorescência. Nossas vesículas contendo proteínas de membrana de 100-400 nm de diâmetro podem ser convertidas em vesículas unilamelares gigantes (GUVs), usando procedimentos existentes, mas otimizados. A abordagem permite a inclusão de componentes solúveis (enzimas, metabólitos, sensores) em vesículas de tamanho micrométrico, aumentando assim o volume dos biorreatores em ordens de magnitude. A rede metabólica contendo GUVs é aprisionada em dispositivos microfluídicos para análise por microscopia óptica.

Introduction

O campo da biologia sintética de baixo para cima concentra-se na construção de células (mínimas) ^1,2 e biorreatores metabólicos para fins biotecnológicos ^3,4 ou biomédicos ^5,6,7,8. A construção de células sintéticas fornece uma plataforma única que permite aos pesquisadores estudar proteínas (de membrana) em condições bem definidas, imitando as de ambientes nativos, permitindo a descoberta de propriedades emergentes ....

Protocol

1. Preparação geral

1. Produtos químicos
   1. Dissolver os lípidos (em pó) a 25 mg/ml em CHCl₃ para a produção de lipossomas pré-formados.
      NOTA: É preferível preparar estoques de lipídios frescos, mas as soluções de estoque também podem ser armazenadas a -20 °C por algumas semanas. Trabalhar com lipídios na forma de pó é mais preciso do que usar lipídios já solubilizados em CHCl₃. O CHCl₃ deve ser manuseado com pipetas e/ou seringas de vidr.......

Discussion

Apresentamos um protocolo para a síntese de proteínas (de membrana) contendo vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico (proteoLUVs) e a conversão de proteoLUVs em vesículas unilamelares gigantes (proteoGUVs). O protocolo deve ser aplicável para a reconstituição de outras proteínas de membrana 13,19,30,40 e o encapsulamento de redes metabólicas diferentes das vias de degradação da L-arginina e síntese de glicerol 3-fosfato aqui apresentadas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	-
D(+)-Sucrose	Formedium	-
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g