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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Apresentamos um protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e outros componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico e micrométrico.

Abstract

Apresentamos um método para incorporar em vesículas redes complexas de proteínas, envolvendo proteínas integrais de membrana, enzimas e sensores baseados em fluorescência, usando componentes purificados. Este método é relevante para o projeto e construção de biorreatores e o estudo de redes complexas de reações metabólicas fora de equilíbrio. Começamos reconstituindo (múltiplas) proteínas de membrana em grandes vesículas unilamelares (LUVs) de acordo com um protocolo desenvolvido anteriormente. Em seguida, encapsulamos uma mistura de enzimas purificadas, metabólitos e sensores baseados em fluorescência (proteínas fluorescentes ou corantes) por meio de congelamento-descongelamento-extrusão e removemos componentes não incorporados por centrifugação e/ou cromatografia de exclusão de tamanho. O desempenho das redes metabólicas é medido em tempo real monitorando a relação ATP / ADP, concentração de metabólitos, pH interno ou outros parâmetros por leitura de fluorescência. Nossas vesículas contendo proteínas de membrana de 100-400 nm de diâmetro podem ser convertidas em vesículas unilamelares gigantes (GUVs), usando procedimentos existentes, mas otimizados. A abordagem permite a inclusão de componentes solúveis (enzimas, metabólitos, sensores) em vesículas de tamanho micrométrico, aumentando assim o volume dos biorreatores em ordens de magnitude. A rede metabólica contendo GUVs é aprisionada em dispositivos microfluídicos para análise por microscopia óptica.

Introduction

O campo da biologia sintética de baixo para cima concentra-se na construção de células (mínimas) 1,2 e biorreatores metabólicos para fins biotecnológicos 3,4 ou biomédicos 5,6,7,8. A construção de células sintéticas fornece uma plataforma única que permite aos pesquisadores estudar proteínas (de membrana) em condições bem definidas, imitando as de ambientes nativos, permitindo a descoberta de propriedades emergentes ....

Protocol

1. Preparação geral

  1. Produtos químicos
    1. Dissolver os lípidos (em pó) a 25 mg/ml em CHCl3 para a produção de lipossomas pré-formados.
      NOTA: É preferível preparar estoques de lipídios frescos, mas as soluções de estoque também podem ser armazenadas a -20 °C por algumas semanas. Trabalhar com lipídios na forma de pó é mais preciso do que usar lipídios já solubilizados em CHCl3. O CHCl3 deve ser manuseado com pipetas e/ou seringas de vidr.......

Representative Results

A reconstituição de proteínas de membrana solubilizadas em lipossomas requer a desestabilização de vesículas pré-formadas. A adição de pequenas quantidades de Triton X-100 resulta inicialmente em um aumento da absorbância a 540 nm (A540) devido a um aumento no espalhamento da luz pelo inchaço das vesículas (Figura 4). O valor máximo de A540 é o ponto em que os lipossomas são saturados com detergente (Rsat), após o qual qualquer adiç?.......

Discussion

Apresentamos um protocolo para a síntese de proteínas (de membrana) contendo vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico (proteoLUVs) e a conversão de proteoLUVs em vesículas unilamelares gigantes (proteoGUVs). O protocolo deve ser aplicável para a reconstituição de outras proteínas de membrana 13,19,30,40 e o encapsulamento de redes metabólicas diferentes das vias de degradação da L-arginina e síntese de glicerol 3-fosfato aqui apresentadas.

Disclosures

Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Aditya Iyer pela clonagem do gene pBAD-PercevalHR e a Gea Schuurman-Wolters por ajudar na produção e purificação de proteínas. A pesquisa foi financiada pelo programa NWO Gravitation "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma AldrichA9414-25g
Amicon cut-off filterSigma AldrichMilipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeadsBioRad152-3920
CHCl3Macron Fine ChemicalsMFCD00000826
D(+)-GlucoseFormedium-
D(+)-SucroseFormedium-
DDMGlyconD97002 -C
Diethyl EtherBiosolve52805
DMSOSigma-Aldrich276855-100ml
DOPCAvanti850375P-1g
DOPEAvanti850725P-1g
DOPGAvanti840475P-1g
DTTFormedium DTT005
EtOHJ.T.Baker AvantorMFCD00003568
ExtruderAvestin IncLF-1
FluorimeterJascoSpectrofluorometer FP-8300
GlycerolBOOM51171608
Gravity flow columnBio-Rad732-1010
Hamilton syringe 100 µLHamilton7656-01
Hamilton syringe 1000 µLHamilton81320
Handheld LCP dispenserArt Robbins Instruments620-411-00
Handheld SonicatorHielscher Ultrasound TechnologyUP50H
HClBOOMx76021889.1000
ImidazoleRothX998.4-250g
K2HPO4Supelco1.05099.1000
KClBOOM76028270.1
KH2PO4Supelco1.04873.1000
KimwipeKimtech Science7552
Large Falcon tube centrifugeEppendorfCentrifuge 5810 R
L-ArginineSigma-AldrichA5006-100G
Light microscopeLeicaDM LS2
L-OrnithineRothT204.1
LSM Laser Scanning Confocal MicroscopeZeissLSM 710 ConfoCor 3
MgCl2Sigma-AldrichM2670-1KG
Microfluidic chipHomemade PDMS basedDOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADPSigma-AldrichA2754-1G
NaClSupelco1.06404.1000
Nanodrop SpectrometerIsogen Life ScienceND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOHSupelco1.06498.1000
Needles for GUVsHenke-Ject14-1457527 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidicsHenke-Ject14-1553818 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ SepharoseCytiva17526802
NigericinSigma-AldrichN7143-5MG
NutatorVWR83007-210
Osmolality meterGonotec SalmenkippOsmomat 3000 basic freezing point osmometer
PlasmacleanerPlasma EtchPE-Avenger
Polycarbonate filterCytiva WhatmanNuclepor Track-Etch Membrane Product: 104171040.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tubeBeckman Coulter355647
PyranineAcros OrganicsH1529-1G
Quartz cuvette (black)Hellma Analytics108B-10-40
Sephadex G-75 resin GE Healthcare17-0050-01
SonicatorSonics Sonics & Materials INCSonics vibra cell
Syringe filterSarstedtFiltropur S plus 0.20.2 µm
Syringe pumpHarvard ApparatusA-42467
Tabletop centrifugeEppendorfcentrifuge 5418
Teflon spacerHomemade Teflon based45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
TrisPanReac AppliChemA1086.1000
Triton X-100Sigma AldrichT8787-100 ml
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima Max-E
UV lampSpectrolineENB-280C/FE
UV/VIS SpectrometerJascoV730 spectrophotometer
ValinomycinSigma-AldrichV0627-10MG
Widefield fluorescence microscopeZeissAxioObserver
β-CaseinSigma AldrichC5890-500g

References

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis o....

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