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Apresentamos um protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e outros componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico e micrométrico.
Apresentamos um método para incorporar em vesículas redes complexas de proteínas, envolvendo proteínas integrais de membrana, enzimas e sensores baseados em fluorescência, usando componentes purificados. Este método é relevante para o projeto e construção de biorreatores e o estudo de redes complexas de reações metabólicas fora de equilíbrio. Começamos reconstituindo (múltiplas) proteínas de membrana em grandes vesículas unilamelares (LUVs) de acordo com um protocolo desenvolvido anteriormente. Em seguida, encapsulamos uma mistura de enzimas purificadas, metabólitos e sensores baseados em fluorescência (proteínas fluorescentes ou corantes) por meio de congelamento-descongelamento-extrusão e removemos componentes não incorporados por centrifugação e/ou cromatografia de exclusão de tamanho. O desempenho das redes metabólicas é medido em tempo real monitorando a relação ATP / ADP, concentração de metabólitos, pH interno ou outros parâmetros por leitura de fluorescência. Nossas vesículas contendo proteínas de membrana de 100-400 nm de diâmetro podem ser convertidas em vesículas unilamelares gigantes (GUVs), usando procedimentos existentes, mas otimizados. A abordagem permite a inclusão de componentes solúveis (enzimas, metabólitos, sensores) em vesículas de tamanho micrométrico, aumentando assim o volume dos biorreatores em ordens de magnitude. A rede metabólica contendo GUVs é aprisionada em dispositivos microfluídicos para análise por microscopia óptica.
O campo da biologia sintética de baixo para cima concentra-se na construção de células (mínimas) 1,2 e biorreatores metabólicos para fins biotecnológicos 3,4 ou biomédicos 5,6,7,8. A construção de células sintéticas fornece uma plataforma única que permite aos pesquisadores estudar proteínas (de membrana) em condições bem definidas, imitando as de ambientes nativos, permitindo a descoberta de propriedades emergentes ....
1. Preparação geral
A reconstituição de proteínas de membrana solubilizadas em lipossomas requer a desestabilização de vesículas pré-formadas. A adição de pequenas quantidades de Triton X-100 resulta inicialmente em um aumento da absorbância a 540 nm (A540) devido a um aumento no espalhamento da luz pelo inchaço das vesículas (Figura 4). O valor máximo de A540 é o ponto em que os lipossomas são saturados com detergente (Rsat), após o qual qualquer adiç?.......
Apresentamos um protocolo para a síntese de proteínas (de membrana) contendo vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico (proteoLUVs) e a conversão de proteoLUVs em vesículas unilamelares gigantes (proteoGUVs). O protocolo deve ser aplicável para a reconstituição de outras proteínas de membrana 13,19,30,40 e o encapsulamento de redes metabólicas diferentes das vias de degradação da L-arginina e síntese de glicerol 3-fosfato aqui apresentadas.
Os autores agradecem a Aditya Iyer pela clonagem do gene pBAD-PercevalHR e a Gea Schuurman-Wolters por ajudar na produção e purificação de proteínas. A pesquisa foi financiada pelo programa NWO Gravitation "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose | Sigma Aldrich | A9414-25g | |
Amicon cut-off filter | Sigma Aldrich | Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra | |
BioBeads | BioRad | 152-3920 | |
CHCl3 | Macron Fine Chemicals | MFCD00000826 | |
D(+)-Glucose | Formedium | - | |
D(+)-Sucrose | Formedium | - | |
DDM | Glycon | D97002 -C | |
Diethyl Ether | Biosolve | 52805 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 276855-100ml | |
DOPC | Avanti | 850375P-1g | |
DOPE | Avanti | 850725P-1g | |
DOPG | Avanti | 840475P-1g | |
DTT | Formedium | DTT005 | |
EtOH | J.T.Baker Avantor | MFCD00003568 | |
Extruder | Avestin Inc | LF-1 | |
Fluorimeter | Jasco | Spectrofluorometer FP-8300 | |
Glycerol | BOOM | 51171608 | |
Gravity flow column | Bio-Rad | 732-1010 | |
Hamilton syringe 100 µL | Hamilton | 7656-01 | |
Hamilton syringe 1000 µL | Hamilton | 81320 | |
Handheld LCP dispenser | Art Robbins Instruments | 620-411-00 | |
Handheld Sonicator | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | |
HCl | BOOM | x76021889.1000 | |
Imidazole | Roth | X998.4-250g | |
K2HPO4 | Supelco | 1.05099.1000 | |
KCl | BOOM | 76028270.1 | |
KH2PO4 | Supelco | 1.04873.1000 | |
Kimwipe | Kimtech Science | 7552 | |
Large Falcon tube centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006-100G | |
Light microscope | Leica | DM LS2 | |
L-Ornithine | Roth | T204.1 | |
LSM Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 ConfoCor 3 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-1KG | |
Microfluidic chip | Homemade | PDMS based | DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J |
Na-ADP | Sigma-Aldrich | A2754-1G | |
NaCl | Supelco | 1.06404.1000 | |
Nanodrop Spectrometer | Isogen Life Science | ND-1000 spectrophotometer NanoDrop | |
NaOH | Supelco | 1.06498.1000 | |
Needles for GUVs | Henke-Ject | 14-14575 | 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm |
Needles for microfluidics | Henke-Ject | 14-15538 | 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm |
Ni2+ Sepharose | Cytiva | 17526802 | |
Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143-5MG | |
Nutator | VWR | 83007-210 | |
Osmolality meter | Gonotec Salmenkipp | Osmomat 3000 basic freezing point osmometer | |
Plasmacleaner | Plasma Etch | PE-Avenger | |
Polycarbonate filter | Cytiva Whatman | Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 | 0.4 µm |
Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 355647 | |
Pyranine | Acros Organics | H1529-1G | |
Quartz cuvette (black) | Hellma Analytics | 108B-10-40 | |
Sephadex G-75 resin | GE Healthcare | 17-0050-01 | |
Sonicator | Sonics Sonics & Materials INC | Sonics vibra cell | |
Syringe filter | Sarstedt | Filtropur S plus 0.2 | 0.2 µm |
Syringe pump | Harvard Apparatus | A-42467 | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf | centrifuge 5418 | |
Teflon spacer | Homemade | Teflon based | 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm |
Tris | PanReac AppliChem | A1086.1000 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100 ml | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima Max-E | |
UV lamp | Spectroline | ENB-280C/FE | |
UV/VIS Spectrometer | Jasco | V730 spectrophotometer | |
Valinomycin | Sigma-Aldrich | V0627-10MG | |
Widefield fluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver | |
β-Casein | Sigma Aldrich | C5890-500g |
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