Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Представлен протокол восстановления мембранных белков и инкапсуляции ферментов и других водорастворимых компонентов в липидных везикулах субмикронного и микрометрового размера.

Abstract

Мы представляем метод встраивания в везикулы сложных белковых сетей, включающих интегральные мембранные белки, ферменты и флуоресцентные сенсоры, с использованием очищенных компонентов. Этот метод актуален для проектирования и строительства биореакторов и исследования сложных неравновесных сетей метаболических реакций. Мы начинаем с восстановления (множественных) мембранных белков в большие униламеллярные везикулы (LUV) в соответствии с ранее разработанным протоколом. Затем мы инкапсулируем смесь очищенных ферментов, метаболитов и флуоресцентных сенсоров (флуоресцентных белков или красителей) с помощью замораживания-размораживания-экструзии и удаляем неинкорпорированные компоненты с помощью центрифугирования и/или эксклюзионной хроматографии. Производительность метаболических сетей измеряется в режиме реального времени путем мониторинга соотношения АТФ/АДФ, концентрации метаболитов, внутреннего pH или других параметров с помощью флуоресцентного считывания. Наши мембранные белкисодержащие везикулы диаметром 100-400 нм могут быть преобразованы в гигантские униламеллярные везикулы (GUV) с использованием существующих, но оптимизированных процедур. Этот подход позволяет включать растворимые компоненты (ферменты, метаболиты, сенсоры) в везикулы микрометрового размера, тем самым увеличивая объем биореакторов на порядки. Метаболическая сеть, содержащая GUV, захватывается микрофлюидными устройствами для анализа с помощью оптической микроскопии.

Introduction

Область синтетической биологии снизу вверх фокусируется на конструировании (минимальных) клеток 1,2 и метаболических биореакторов для биотехнологических 3,4 или биомедицинских целей 5,6,7,8. Конструирование синтетических клеток обеспечивает уникальную платформу, которая позволяет исследователям изучать (мембранные) белки в четко определенных условиях, имитирующих условия нативной среды, что позволяет обнаружить эмерд....

Protocol

1. Общая подготовка

  1. Химикалии
    1. Растворите липиды (в виде порошка) до 25 мг/мл в CHCl3 для получения предварительно сформированных липосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно готовить свежие липидные запасы, но исходные растворы также могут храниться при температуре -20 °C в.......

Representative Results

Восстановление солюбилизированных мембранных белков в липосомах требует дестабилизации предварительно сформированных везикул. Добавление небольших количеств Triton X-100 первоначально приводит к увеличению поглощения на длине волны 540 нм (A540) из-за увеличения рассеяния света за сч?.......

Discussion

Мы представляем протокол синтеза (мембранного) белка, содержащего липидные везикулы субмикронного размера (proteoLUVs), и превращения proteoLUV в гигантско-униламеллярные везикулы (proteoGUVs). Протокол должен быть применим для восстановления других мембранных белков 13,19,30,40 и инкапсуляции метаболи?.......

Acknowledgements

Авторы благодарят Адитью Айер за клонирование гена pBAD-PercevalHR и Геа Шуурман-Уолтерс за помощь в производстве и очистке белка. Исследование финансировалось в рамках программы NWO Gravitation «Построение синтетической клетки» (BaSyC).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma AldrichA9414-25g
Amicon cut-off filterSigma AldrichMilipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeadsBioRad152-3920
CHCl3Macron Fine ChemicalsMFCD00000826
D(+)-GlucoseFormedium-
D(+)-SucroseFormedium-
DDMGlyconD97002 -C
Diethyl EtherBiosolve52805
DMSOSigma-Aldrich276855-100ml
DOPCAvanti850375P-1g
DOPEAvanti850725P-1g
DOPGAvanti840475P-1g
DTTFormedium DTT005
EtOHJ.T.Baker AvantorMFCD00003568
ExtruderAvestin IncLF-1
FluorimeterJascoSpectrofluorometer FP-8300
GlycerolBOOM51171608
Gravity flow columnBio-Rad732-1010
Hamilton syringe 100 µLHamilton7656-01
Hamilton syringe 1000 µLHamilton81320
Handheld LCP dispenserArt Robbins Instruments620-411-00
Handheld SonicatorHielscher Ultrasound TechnologyUP50H
HClBOOMx76021889.1000
ImidazoleRothX998.4-250g
K2HPO4Supelco1.05099.1000
KClBOOM76028270.1
KH2PO4Supelco1.04873.1000
KimwipeKimtech Science7552
Large Falcon tube centrifugeEppendorfCentrifuge 5810 R
L-ArginineSigma-AldrichA5006-100G
Light microscopeLeicaDM LS2
L-OrnithineRothT204.1
LSM Laser Scanning Confocal MicroscopeZeissLSM 710 ConfoCor 3
MgCl2Sigma-AldrichM2670-1KG
Microfluidic chipHomemade PDMS basedDOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADPSigma-AldrichA2754-1G
NaClSupelco1.06404.1000
Nanodrop SpectrometerIsogen Life ScienceND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOHSupelco1.06498.1000
Needles for GUVsHenke-Ject14-1457527 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidicsHenke-Ject14-1553818 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ SepharoseCytiva17526802
NigericinSigma-AldrichN7143-5MG
NutatorVWR83007-210
Osmolality meterGonotec SalmenkippOsmomat 3000 basic freezing point osmometer
PlasmacleanerPlasma EtchPE-Avenger
Polycarbonate filterCytiva WhatmanNuclepor Track-Etch Membrane Product: 104171040.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tubeBeckman Coulter355647
PyranineAcros OrganicsH1529-1G
Quartz cuvette (black)Hellma Analytics108B-10-40
Sephadex G-75 resin GE Healthcare17-0050-01
SonicatorSonics Sonics & Materials INCSonics vibra cell
Syringe filterSarstedtFiltropur S plus 0.20.2 µm
Syringe pumpHarvard ApparatusA-42467
Tabletop centrifugeEppendorfcentrifuge 5418
Teflon spacerHomemade Teflon based45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
TrisPanReac AppliChemA1086.1000
Triton X-100Sigma AldrichT8787-100 ml
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima Max-E
UV lampSpectrolineENB-280C/FE
UV/VIS SpectrometerJascoV730 spectrophotometer
ValinomycinSigma-AldrichV0627-10MG
Widefield fluorescence microscopeZeissAxioObserver
β-CaseinSigma AldrichC5890-500g

References

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis o....

Explore More Articles

LUVGUV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved