A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Представлен протокол восстановления мембранных белков и инкапсуляции ферментов и других водорастворимых компонентов в липидных везикулах субмикронного и микрометрового размера.
Мы представляем метод встраивания в везикулы сложных белковых сетей, включающих интегральные мембранные белки, ферменты и флуоресцентные сенсоры, с использованием очищенных компонентов. Этот метод актуален для проектирования и строительства биореакторов и исследования сложных неравновесных сетей метаболических реакций. Мы начинаем с восстановления (множественных) мембранных белков в большие униламеллярные везикулы (LUV) в соответствии с ранее разработанным протоколом. Затем мы инкапсулируем смесь очищенных ферментов, метаболитов и флуоресцентных сенсоров (флуоресцентных белков или красителей) с помощью замораживания-размораживания-экструзии и удаляем неинкорпорированные компоненты с помощью центрифугирования и/или эксклюзионной хроматографии. Производительность метаболических сетей измеряется в режиме реального времени путем мониторинга соотношения АТФ/АДФ, концентрации метаболитов, внутреннего pH или других параметров с помощью флуоресцентного считывания. Наши мембранные белкисодержащие везикулы диаметром 100-400 нм могут быть преобразованы в гигантские униламеллярные везикулы (GUV) с использованием существующих, но оптимизированных процедур. Этот подход позволяет включать растворимые компоненты (ферменты, метаболиты, сенсоры) в везикулы микрометрового размера, тем самым увеличивая объем биореакторов на порядки. Метаболическая сеть, содержащая GUV, захватывается микрофлюидными устройствами для анализа с помощью оптической микроскопии.
Область синтетической биологии снизу вверх фокусируется на конструировании (минимальных) клеток 1,2 и метаболических биореакторов для биотехнологических 3,4 или биомедицинских целей 5,6,7,8. Конструирование синтетических клеток обеспечивает уникальную платформу, которая позволяет исследователям изучать (мембранные) белки в четко определенных условиях, имитирующих условия нативной среды, что позволяет обнаружить эмерд....
1. Общая подготовка
Восстановление солюбилизированных мембранных белков в липосомах требует дестабилизации предварительно сформированных везикул. Добавление небольших количеств Triton X-100 первоначально приводит к увеличению поглощения на длине волны 540 нм (A540) из-за увеличения рассеяния света за сч?.......
Мы представляем протокол синтеза (мембранного) белка, содержащего липидные везикулы субмикронного размера (proteoLUVs), и превращения proteoLUV в гигантско-униламеллярные везикулы (proteoGUVs). Протокол должен быть применим для восстановления других мембранных белков 13,19,30,40 и инкапсуляции метаболи?.......
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Авторы благодарят Адитью Айер за клонирование гена pBAD-PercevalHR и Геа Шуурман-Уолтерс за помощь в производстве и очистке белка. Исследование финансировалось в рамках программы NWO Gravitation «Построение синтетической клетки» (BaSyC).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose | Sigma Aldrich | A9414-25g | |
Amicon cut-off filter | Sigma Aldrich | Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra | |
BioBeads | BioRad | 152-3920 | |
CHCl3 | Macron Fine Chemicals | MFCD00000826 | |
D(+)-Glucose | Formedium | - | |
D(+)-Sucrose | Formedium | - | |
DDM | Glycon | D97002 -C | |
Diethyl Ether | Biosolve | 52805 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 276855-100ml | |
DOPC | Avanti | 850375P-1g | |
DOPE | Avanti | 850725P-1g | |
DOPG | Avanti | 840475P-1g | |
DTT | Formedium | DTT005 | |
EtOH | J.T.Baker Avantor | MFCD00003568 | |
Extruder | Avestin Inc | LF-1 | |
Fluorimeter | Jasco | Spectrofluorometer FP-8300 | |
Glycerol | BOOM | 51171608 | |
Gravity flow column | Bio-Rad | 732-1010 | |
Hamilton syringe 100 µL | Hamilton | 7656-01 | |
Hamilton syringe 1000 µL | Hamilton | 81320 | |
Handheld LCP dispenser | Art Robbins Instruments | 620-411-00 | |
Handheld Sonicator | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | |
HCl | BOOM | x76021889.1000 | |
Imidazole | Roth | X998.4-250g | |
K2HPO4 | Supelco | 1.05099.1000 | |
KCl | BOOM | 76028270.1 | |
KH2PO4 | Supelco | 1.04873.1000 | |
Kimwipe | Kimtech Science | 7552 | |
Large Falcon tube centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006-100G | |
Light microscope | Leica | DM LS2 | |
L-Ornithine | Roth | T204.1 | |
LSM Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 ConfoCor 3 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-1KG | |
Microfluidic chip | Homemade | PDMS based | DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J |
Na-ADP | Sigma-Aldrich | A2754-1G | |
NaCl | Supelco | 1.06404.1000 | |
Nanodrop Spectrometer | Isogen Life Science | ND-1000 spectrophotometer NanoDrop | |
NaOH | Supelco | 1.06498.1000 | |
Needles for GUVs | Henke-Ject | 14-14575 | 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm |
Needles for microfluidics | Henke-Ject | 14-15538 | 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm |
Ni2+ Sepharose | Cytiva | 17526802 | |
Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143-5MG | |
Nutator | VWR | 83007-210 | |
Osmolality meter | Gonotec Salmenkipp | Osmomat 3000 basic freezing point osmometer | |
Plasmacleaner | Plasma Etch | PE-Avenger | |
Polycarbonate filter | Cytiva Whatman | Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 | 0.4 µm |
Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 355647 | |
Pyranine | Acros Organics | H1529-1G | |
Quartz cuvette (black) | Hellma Analytics | 108B-10-40 | |
Sephadex G-75 resin | GE Healthcare | 17-0050-01 | |
Sonicator | Sonics Sonics & Materials INC | Sonics vibra cell | |
Syringe filter | Sarstedt | Filtropur S plus 0.2 | 0.2 µm |
Syringe pump | Harvard Apparatus | A-42467 | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf | centrifuge 5418 | |
Teflon spacer | Homemade | Teflon based | 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm |
Tris | PanReac AppliChem | A1086.1000 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100 ml | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima Max-E | |
UV lamp | Spectroline | ENB-280C/FE | |
UV/VIS Spectrometer | Jasco | V730 spectrophotometer | |
Valinomycin | Sigma-Aldrich | V0627-10MG | |
Widefield fluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver | |
β-Casein | Sigma Aldrich | C5890-500g |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved