Построение неравновесных метаболических сетей в нано- и микрометровых везикулах

Summary

Представлен протокол восстановления мембранных белков и инкапсуляции ферментов и других водорастворимых компонентов в липидных везикулах субмикронного и микрометрового размера.

Abstract

Мы представляем метод встраивания в везикулы сложных белковых сетей, включающих интегральные мембранные белки, ферменты и флуоресцентные сенсоры, с использованием очищенных компонентов. Этот метод актуален для проектирования и строительства биореакторов и исследования сложных неравновесных сетей метаболических реакций. Мы начинаем с восстановления (множественных) мембранных белков в большие униламеллярные везикулы (LUV) в соответствии с ранее разработанным протоколом. Затем мы инкапсулируем смесь очищенных ферментов, метаболитов и флуоресцентных сенсоров (флуоресцентных белков или красителей) с помощью замораживания-размораживания-экструзии и удаляем неинкорпорированные компоненты с помощью центрифугирования и/или эксклюзионной хроматографии. Производительность метаболических сетей измеряется в режиме реального времени путем мониторинга соотношения АТФ/АДФ, концентрации метаболитов, внутреннего pH или других параметров с помощью флуоресцентного считывания. Наши мембранные белкисодержащие везикулы диаметром 100-400 нм могут быть преобразованы в гигантские униламеллярные везикулы (GUV) с использованием существующих, но оптимизированных процедур. Этот подход позволяет включать растворимые компоненты (ферменты, метаболиты, сенсоры) в везикулы микрометрового размера, тем самым увеличивая объем биореакторов на порядки. Метаболическая сеть, содержащая GUV, захватывается микрофлюидными устройствами для анализа с помощью оптической микроскопии.

Introduction

Область синтетической биологии снизу вверх фокусируется на конструировании (минимальных) клеток ^1,2 и метаболических биореакторов для биотехнологических ^3,4 или биомедицинских целей 5,6,7,8. Конструирование синтетических клеток обеспечивает уникальную платформу, которая позволяет исследователям изучать (мембранные) белки в четко определенных условиях, имитирующих условия нативной среды, что позволяет обнаружить эмерд....

Protocol

1. Общая подготовка

1. Химикалии
   1. Растворите липиды (в виде порошка) до 25 мг/мл в CHCl₃ для получения предварительно сформированных липосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно готовить свежие липидные запасы, но исходные растворы также могут храниться при температуре -20 °C в.......

Discussion

Мы представляем протокол синтеза (мембранного) белка, содержащего липидные везикулы субмикронного размера (proteoLUVs), и превращения proteoLUV в гигантско-униламеллярные везикулы (proteoGUVs). Протокол должен быть применим для восстановления других мембранных белков 13,19,30,40 и инкапсуляции метаболи?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	-
D(+)-Sucrose	Formedium	-
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g