Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Представлен протокол восстановления мембранных белков и инкапсуляции ферментов и других водорастворимых компонентов в липидных везикулах субмикронного и микрометрового размера.

Abstract

Мы представляем метод встраивания в везикулы сложных белковых сетей, включающих интегральные мембранные белки, ферменты и флуоресцентные сенсоры, с использованием очищенных компонентов. Этот метод актуален для проектирования и строительства биореакторов и исследования сложных неравновесных сетей метаболических реакций. Мы начинаем с восстановления (множественных) мембранных белков в большие униламеллярные везикулы (LUV) в соответствии с ранее разработанным протоколом. Затем мы инкапсулируем смесь очищенных ферментов, метаболитов и флуоресцентных сенсоров (флуоресцентных белков или красителей) с помощью замораживания-размораживания-экструзии и удаляем неинкорпорированные компоненты с помощью центрифугирования и/или эксклюзионной хроматографии. Производительность метаболических сетей измеряется в режиме реального времени путем мониторинга соотношения АТФ/АДФ, концентрации метаболитов, внутреннего pH или других параметров с помощью флуоресцентного считывания. Наши мембранные белкисодержащие везикулы диаметром 100-400 нм могут быть преобразованы в гигантские униламеллярные везикулы (GUV) с использованием существующих, но оптимизированных процедур. Этот подход позволяет включать растворимые компоненты (ферменты, метаболиты, сенсоры) в везикулы микрометрового размера, тем самым увеличивая объем биореакторов на порядки. Метаболическая сеть, содержащая GUV, захватывается микрофлюидными устройствами для анализа с помощью оптической микроскопии.

Introduction

Область синтетической биологии снизу вверх фокусируется на конструировании (минимальных) клеток 1,2 и метаболических биореакторов для биотехнологических 3,4 или биомедицинских целей 5,6,7,8. Конструирование синтетических клеток обеспечивает уникальную платформу, которая позволяет исследователям изучать (мембранные) белки в четко определенных условиях, имитирующих условия нативной среды, что позволяет обнаружить эмерд....

Protocol

1. Общая подготовка

  1. Химикалии
    1. Растворите липиды (в виде порошка) до 25 мг/мл в CHCl3 для получения предварительно сформированных липосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно готовить свежие липидные запасы, но исходные растворы также могут храниться при температуре -20 °C в.......

Representative Results

Восстановление солюбилизированных мембранных белков в липосомах требует дестабилизации предварительно сформированных везикул. Добавление небольших количеств Triton X-100 первоначально приводит к увеличению поглощения на длине волны 540 нм (A540) из-за увеличения рассеяния света за сч?.......

Discussion

Мы представляем протокол синтеза (мембранного) белка, содержащего липидные везикулы субмикронного размера (proteoLUVs), и превращения proteoLUV в гигантско-униламеллярные везикулы (proteoGUVs). Протокол должен быть применим для восстановления других мембранных белков 13,19,30,40 и инкапсуляции метаболи?.......

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

Авторы благодарят Адитью Айер за клонирование гена pBAD-PercevalHR и Геа Шуурман-Уолтерс за помощь в производстве и очистке белка. Исследование финансировалось в рамках программы NWO Gravitation «Построение синтетической клетки» (BaSyC).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma AldrichA9414-25g
Amicon cut-off filterSigma AldrichMilipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeadsBioRad152-3920
CHCl3Macron Fine ChemicalsMFCD00000826
D(+)-GlucoseFormedium-
D(+)-SucroseFormedium-
DDMGlyconD97002 -C
Diethyl EtherBiosolve52805
DMSOSigma-Aldrich276855-100ml
DOPCAvanti850375P-1g
DOPEAvanti850725P-1g
DOPGAvanti840475P-1g
DTTFormedium DTT005
EtOHJ.T.Baker AvantorMFCD00003568
ExtruderAvestin IncLF-1
FluorimeterJascoSpectrofluorometer FP-8300
GlycerolBOOM51171608
Gravity flow columnBio-Rad732-1010
Hamilton syringe 100 µLHamilton7656-01
Hamilton syringe 1000 µLHamilton81320
Handheld LCP dispenserArt Robbins Instruments620-411-00
Handheld SonicatorHielscher Ultrasound TechnologyUP50H
HClBOOMx76021889.1000
ImidazoleRothX998.4-250g
K2HPO4Supelco1.05099.1000
KClBOOM76028270.1
KH2PO4Supelco1.04873.1000
KimwipeKimtech Science7552
Large Falcon tube centrifugeEppendorfCentrifuge 5810 R
L-ArginineSigma-AldrichA5006-100G
Light microscopeLeicaDM LS2
L-OrnithineRothT204.1
LSM Laser Scanning Confocal MicroscopeZeissLSM 710 ConfoCor 3
MgCl2Sigma-AldrichM2670-1KG
Microfluidic chipHomemade PDMS basedDOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADPSigma-AldrichA2754-1G
NaClSupelco1.06404.1000
Nanodrop SpectrometerIsogen Life ScienceND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOHSupelco1.06498.1000
Needles for GUVsHenke-Ject14-1457527 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidicsHenke-Ject14-1553818 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ SepharoseCytiva17526802
NigericinSigma-AldrichN7143-5MG
NutatorVWR83007-210
Osmolality meterGonotec SalmenkippOsmomat 3000 basic freezing point osmometer
PlasmacleanerPlasma EtchPE-Avenger
Polycarbonate filterCytiva WhatmanNuclepor Track-Etch Membrane Product: 104171040.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tubeBeckman Coulter355647
PyranineAcros OrganicsH1529-1G
Quartz cuvette (black)Hellma Analytics108B-10-40
Sephadex G-75 resin GE Healthcare17-0050-01
SonicatorSonics Sonics & Materials INCSonics vibra cell
Syringe filterSarstedtFiltropur S plus 0.20.2 µm
Syringe pumpHarvard ApparatusA-42467
Tabletop centrifugeEppendorfcentrifuge 5418
Teflon spacerHomemade Teflon based45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
TrisPanReac AppliChemA1086.1000
Triton X-100Sigma AldrichT8787-100 ml
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima Max-E
UV lampSpectrolineENB-280C/FE
UV/VIS SpectrometerJascoV730 spectrophotometer
ValinomycinSigma-AldrichV0627-10MG
Widefield fluorescence microscopeZeissAxioObserver
β-CaseinSigma AldrichC5890-500g

References

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis o....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

LUVGUV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved