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Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.
Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Esse processo é crucial para o funcionamento adequado do cérebro, e sua desregulação pode resultar em distúrbios do neurodesenvolvimento e psiquiátricos após o nascimento. De fato, muitos genes responsáveis por essas doenças estão envolvidos nesse processo e, portanto, revelar como essas mutações afetam a dinâmica celular é importante para entender a patogênese dessas doenças. Este protocolo introduz uma técnica para imagens de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro obtidas de embriões de camundongos. As células são marcadas com proteínas fluorescentes usando eletroporação in utero , que visualiza células individuais migrando da zona ventricular com uma alta relação sinal-ruído. Além disso, este sistema de transferência de genes in vivo nos permite realizar facilmente experimentos de ganho de função ou perda de função nos genes dados por co-eletroporação de sua expressão ou vetores de knockdown/knockout. Usando este protocolo, o comportamento migratório e a velocidade de migração de células individuais, informações que nunca são obtidas de cérebros fixos, podem ser analisados.
Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, a glia radial (apical) na zona ventricular palial (VZ) que reveste o ventrículo lateral produz primeiro neurônios e depois progenitores gliais com algum período de sobreposição1. Os neurônios também são gerados a partir de progenitores intermediários ou glia radial basal na zona subventricular (SVZ) adjacente à VZ, ambas originadas da glia radial (apical) 2,3. Em camundongos, as células gliais radiais produzem apenas neurônios no dia embrionário (E) 12-14, neurônios e progenitores gliais em E15-16 e progenitores gliais de E17 em diante
O presente estudo foi realizado com a aprovação e seguindo as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Pesquisa do Desenvolvimento, Centro de Deficiência do Desenvolvimento de Aichi (# 2019-013) e Universidade de Keio (A2021-030). Camundongos ICR (tipo selvagem) prenhes cronometrados foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais). Para observar a relação entre células migratórias e vasos sanguíneos, foram utilizados camundongos Flt1-DsRed, nos quais as células .......
As células gliais radiais na VZ palial produzem apenas neurônios até E14, e neurônios e células gliais em E15 e E16. Para observar os comportamentos migratórios de neurônios e células gliais simultaneamente, nós os rotulamos com GFP aprimorado (EGFP) e RFP, respectivamente, usando um promotor específico de neurônio, o promotor Tα127 e o promotor da proteína ácida fibrilar glial humana (hGFAP)28, que é preferencialmente ativado em astrócitos. Os prog.......
Este protocolo introduziu um método para a observação de lapso de tempo de células derivadas do VZ palial (cortical). Para rotular as células migratórias do VZ, usamos a eletroporação no útero, na qual as células individuais foram claramente marcadas com uma relação sinal-ruído mais alta do que na marcação mediada por vetor viral. Usando a eletroporação in utero, qualquer tipo de vetor em qualquer combinação pode ser facilmente introduzido nas células gliais radiais (células-tronco .......
O promotorT α1 é um presente de P. Barker e F.D. Miller. O promotor Dcx é um presente de Q. Lu. hGFAP-Cre foi um presente de Albee Messing. O sistema vetorial de transposon PiggyBac foi fornecido pelo Instituto Sanger. Os camundongos Flt1-DsRed foram fornecidos por M. Ema (Universidade de Shiga). Este trabalho foi apoiado pela JSPS KAKENHI (Grant Number JP21K07309 para H. Tabata, JP20H05688 e JP22K19365 para K. Nakajima) e Takeda Science Foundation, Keio Gijuku Fukuzawa Memorial Fund for the Advancement of Education and Research, Keio Gijuku Academic Development Funds para K. Nakajima.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | |
Atipamezole (5 mg/mL) | Meiji | Mepatia | |
Autoclip | Becton Dickinson | 427630 | 9 mm |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Butorphanol (5 mg/mL) | Meiji | Vetorphale | |
Cell culture insert | Millipore | PICM ORG 50 | |
Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC) |
Cryomold | Tissue-Tek | 4566 | |
Culture chamber | Tokken | TK-NBCMP | Custom-made |
Electroporator | NEPA Gene | NEPA21 | |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
Gas mixer | Tokken | TK-MIGM01-02 | |
Glass base dish | Iwaki | 3910-035 | Diameter of glass base is 27 mm |
Glass capillaries | Narishige | GD-1 | |
HBS (2x) | Sigma-Aldrich | 51558 | |
HBSS(-) | Wako | 084-08345 | |
Heater Unit | Tokken | TK-0003HU20 | Custom-made, including hood and heater |
hGFAP-Cre | Addgene | #40591 | A gift from Albee Messing |
ImageJ | https://imagej.net/ij/ | ||
L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
Low melting temperature agarose | Lonza | 50100 | |
Medetomidine (1 mg/mL) | Meiji | Medetomin | |
Microinjector | Narishige | IM-300 | |
Midazolam (5 mg/mL) | Sandoz | Midazolam | |
MTrackJ | https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | ||
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
pCAG-hyPBase | The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki). | ||
pDcx-Dre | The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272). | ||
Penicillin + Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Plasmid purification kit | Invitrogen | PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005) | |
pPB-CAG-LNL-RFP | CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). | ||
pPB-CAG-rDIO-EGFP | The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File. | ||
Puller | Narishige | PN-31 | |
StackRed | a plugin for ImageJ | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | |
Suture needle | Nazme | C-24-521-R No.1 | 1/2 circle, length 14 mm |
Suture thread | Nazme | C-23-B2 | Silk, size 5-0 |
Timed pregnant ICR (wild-type) mice | Japan SLC | ICR mouse | |
TrackMate | https://imagej.net/plugins/trackmate/index | ||
Tweezer-type electrode | BEX or NEPA Gene | CUY650P5 | |
Tα1-EGFP | EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller) | ||
Vibrating microtome | Leica or Zeiss | Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50. |
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