Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Summary

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Abstract

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Esse processo é crucial para o funcionamento adequado do cérebro, e sua desregulação pode resultar em distúrbios do neurodesenvolvimento e psiquiátricos após o nascimento. De fato, muitos genes responsáveis por essas doenças estão envolvidos nesse processo e, portanto, revelar como essas mutações afetam a dinâmica celular é importante para entender a patogênese dessas doenças. Este protocolo introduz uma técnica para imagens de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro obtidas de embriões de camundongos. As células são marcadas com proteínas fluorescentes usando eletroporação in utero , que visualiza células individuais migrando da zona ventricular com uma alta relação sinal-ruído. Além disso, este sistema de transferência de genes in vivo nos permite realizar facilmente experimentos de ganho de função ou perda de função nos genes dados por co-eletroporação de sua expressão ou vetores de knockdown/knockout. Usando este protocolo, o comportamento migratório e a velocidade de migração de células individuais, informações que nunca são obtidas de cérebros fixos, podem ser analisados.

Introduction

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, a glia radial (apical) na zona ventricular palial (VZ) que reveste o ventrículo lateral produz primeiro neurônios e depois progenitores gliais com algum período de sobreposição¹. Os neurônios também são gerados a partir de progenitores intermediários ou glia radial basal na zona subventricular (SVZ) adjacente à VZ, ambas originadas da glia radial (apical) ^2,3. Em camundongos, as células gliais radiais produzem apenas neurônios no dia embrionário (E) 12-14, neurônios e progenitores gliais em E15-16 e progenitores gliais de E17 em diante

Protocol

O presente estudo foi realizado com a aprovação e seguindo as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Pesquisa do Desenvolvimento, Centro de Deficiência do Desenvolvimento de Aichi (# 2019-013) e Universidade de Keio (A2021-030). Camundongos ICR (tipo selvagem) prenhes cronometrados foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais). Para observar a relação entre células migratórias e vasos sanguíneos, foram utilizados camundongos Flt1-DsRed, nos quais as células .......

Discussion

Este protocolo introduziu um método para a observação de lapso de tempo de células derivadas do VZ palial (cortical). Para rotular as células migratórias do VZ, usamos a eletroporação no útero, na qual as células individuais foram claramente marcadas com uma relação sinal-ruído mais alta do que na marcação mediada por vetor viral. Usando a eletroporação in utero, qualquer tipo de vetor em qualquer combinação pode ser facilmente introduzido nas células gliais radiais (células-tronco .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.