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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Abstract

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Esse processo é crucial para o funcionamento adequado do cérebro, e sua desregulação pode resultar em distúrbios do neurodesenvolvimento e psiquiátricos após o nascimento. De fato, muitos genes responsáveis por essas doenças estão envolvidos nesse processo e, portanto, revelar como essas mutações afetam a dinâmica celular é importante para entender a patogênese dessas doenças. Este protocolo introduz uma técnica para imagens de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro obtidas de embriões de camundongos. As células são marcadas com proteínas fluorescentes usando eletroporação in utero , que visualiza células individuais migrando da zona ventricular com uma alta relação sinal-ruído. Além disso, este sistema de transferência de genes in vivo nos permite realizar facilmente experimentos de ganho de função ou perda de função nos genes dados por co-eletroporação de sua expressão ou vetores de knockdown/knockout. Usando este protocolo, o comportamento migratório e a velocidade de migração de células individuais, informações que nunca são obtidas de cérebros fixos, podem ser analisados.

Introduction

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, a glia radial (apical) na zona ventricular palial (VZ) que reveste o ventrículo lateral produz primeiro neurônios e depois progenitores gliais com algum período de sobreposição1. Os neurônios também são gerados a partir de progenitores intermediários ou glia radial basal na zona subventricular (SVZ) adjacente à VZ, ambas originadas da glia radial (apical) 2,3. Em camundongos, as células gliais radiais produzem apenas neurônios no dia embrionário (E) 12-14, neurônios e progenitores gliais em E15-16 e progenitores gliais de E17 em diante

Protocol

O presente estudo foi realizado com a aprovação e seguindo as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Pesquisa do Desenvolvimento, Centro de Deficiência do Desenvolvimento de Aichi (# 2019-013) e Universidade de Keio (A2021-030). Camundongos ICR (tipo selvagem) prenhes cronometrados foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais). Para observar a relação entre células migratórias e vasos sanguíneos, foram utilizados camundongos Flt1-DsRed, nos quais as células .......

Representative Results

As células gliais radiais na VZ palial produzem apenas neurônios até E14, e neurônios e células gliais em E15 e E16. Para observar os comportamentos migratórios de neurônios e células gliais simultaneamente, nós os rotulamos com GFP aprimorado (EGFP) e RFP, respectivamente, usando um promotor específico de neurônio, o promotor Tα127 e o promotor da proteína ácida fibrilar glial humana (hGFAP)28, que é preferencialmente ativado em astrócitos. Os prog.......

Discussion

Este protocolo introduziu um método para a observação de lapso de tempo de células derivadas do VZ palial (cortical). Para rotular as células migratórias do VZ, usamos a eletroporação no útero, na qual as células individuais foram claramente marcadas com uma relação sinal-ruído mais alta do que na marcação mediada por vetor viral. Usando a eletroporação in utero, qualquer tipo de vetor em qualquer combinação pode ser facilmente introduzido nas células gliais radiais (células-tronco .......

Acknowledgements

O promotorT α1 é um presente de P. Barker e F.D. Miller. O promotor Dcx é um presente de Q. Lu. hGFAP-Cre foi um presente de Albee Messing. O sistema vetorial de transposon PiggyBac foi fornecido pelo Instituto Sanger. Os camundongos Flt1-DsRed foram fornecidos por M. Ema (Universidade de Shiga). Este trabalho foi apoiado pela JSPS KAKENHI (Grant Number JP21K07309 para H. Tabata, JP20H05688 e JP22K19365 para K. Nakajima) e Takeda Science Foundation, Keio Gijuku Fukuzawa Memorial Fund for the Advancement of Education and Research, Keio Gijuku Academic Development Funds para K. Nakajima.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Aspirator tube assemblyDrummond2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)MeijiMepatia
AutoclipBecton Dickinson4276309 mm
B27 supplementGibco17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)MeijiVetorphale
Cell culture insertMilliporePICM ORG 50
Confocal microscopeNikonA1RHD25Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
CryomoldTissue-Tek4566
Culture chamberTokkenTK-NBCMPCustom-made
ElectroporatorNEPA GeneNEPA21
Fast GreenSigma-AldrichF7258
Gas mixerTokkenTK-MIGM01-02
Glass base dishIwaki3910-035Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillariesNarishigeGD-1
HBS (2x)Sigma-Aldrich51558
HBSS(-)Wako084-08345
Heater UnitTokkenTK-0003HU20Custom-made, including hood and heater
hGFAP-CreAddgene#40591A gift from Albee Messing
ImageJhttps://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)Gibco25030
Low melting temperature agaroseLonza50100
Medetomidine (1 mg/mL)MeijiMedetomin
MicroinjectorNarishigeIM-300
Midazolam (5 mg/mL)SandozMidazolam
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal mediumGibco21103-049
pCAG-hyPBaseThe hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-DreThe Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + StreptomycinGibco15140122
Plasmid purification kitInvitrogenPureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFPCAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFPThe sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
PullerNarishigePN-31
StackReda plugin for ImageJhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needleNazmeC-24-521-R No.11/2 circle, length 14 mm
Suture threadNazmeC-23-B2Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) miceJapan SLCICR mouse
TrackMatehttps://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrodeBEX or NEPA GeneCUY650P5 
Tα1-EGFPEGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtomeLeica or ZeissVibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.

References

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
  2. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R.

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Keywords Imagem de lapso de tempomigra o de neur niosmigra o de progenitores gliaisfatias de c rebro de camundongo embrion riodesenvolvimento do c rtex cerebralzona ventricularsuperf cie cerebraldist rbios do neurodesenvolvimentodist rbios psiqui tricoseletropora o in uteromarca o fluorescente de prote nasmanipula o g nicacomportamento migrat riovelocidade de migra oimagem de c lulas vivas

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