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* These authors contributed equally
Il presente studio riporta un protocollo più semplice, rapido ed economico per isolare e far crescere in modo efficiente le cellule epiteliali mammarie umane primarie (HMEC) da piccole quantità di tessuto mammario. Questo protocollo è adatto per la produzione rapida di HMEC primari sia per applicazioni di laboratorio che cliniche.
La ghiandola mammaria è una struttura fondamentale del seno e svolge un ruolo essenziale nella riproduzione. Le cellule epiteliali mammarie umane (HMEC), che sono le cellule originarie del cancro al seno e di altre malattie infiammatorie correlate al seno, hanno attirato una notevole attenzione. Tuttavia, l'isolamento e la coltura di HMEC primari in vitro per scopi di ricerca è stato impegnativo a causa della loro natura altamente differenziata e cheratinizzazione e della loro breve durata. Pertanto, lo sviluppo di un metodo semplice ed efficiente per isolare e coltivare gli HMEC è di grande valore scientifico per lo studio della biologia mammaria e delle malattie correlate al seno. In questo studio, siamo riusciti a isolare gli HMEC primari da piccole quantità di tessuto mammario mediante digestione con una miscela di enzimi combinata con una coltura iniziale in siero fetale bovino-DMEM al 5% contenente l'inibitore della chinasi associata a Rho (ROCK) Y-27632, seguita da espansione della coltura in terreno cheratinocitario privo di siero. Questo approccio promuove selettivamente la crescita delle cellule epiteliali, con conseguente resa cellulare ottimizzata. La semplicità e la convenienza di questo metodo lo rendono adatto sia per la ricerca di laboratorio che per quella clinica, che dovrebbe fornire preziose informazioni su queste importanti aree di studio.
Il cancro al seno è il principale tipo di cancro diagnosticato nelle donne a livello globale ed è la principale causa di morte per cancro1. La patogenesi del cancro al seno è complessa e coinvolge molteplici fattori come la genetica, l'ambiente e lo stile di vita. Le HMEC, cellule attive che producono latte, sono uno dei componenti più importanti del tessuto mammario e probabilmente sono le cellule originali coinvolte nella carcinogenesi del cancro al seno. Pertanto, gli HMEC hanno ricevuto la massima attenzione dai ricercatori per lo studio del cancro al seno2. Inoltre, le cellule primarie hanno la capacità di fornire u....
I tessuti mammari freschi e normali utilizzati in questo protocollo vengono raccolti dalla chirurgia intorno alla lesione della mastite lobulare granulomatosa refrattaria nel primo ospedale affiliato dell'Università di medicina cinese di Zhejiang secondo le linee guida del Comitato etico medico del primo ospedale affiliato dell'Università di medicina cinese di Zhejiang (protocollo n. ChiMCTR2100005281, Data: 2017-07-17).
1. Acquisizione di tessuti
Nella Figura 1 viene illustrato uno schema della procedura. Il protocollo prevede l'uso di una combinazione di enzimi, vale a dire dispasi, collagenasi e tripsina. Questa combinazione viene utilizzata allo scopo di staccare il foglio epiteliale dallo strato di fibroblasti sottostante e successivamente utilizzare la tripsina per dissociare le cellule epiteliali mammarie in una sospensione. Inoltre, la crescita delle cellule epiteliali è stata efficacemente promossa aggiungendo Y-27632 al ter.......
Gli HMEC sono vitali per preservare l'integrità anatomica e funzionale del tessuto mammario e sono utili nelle indagini scientifiche, nelle implementazioni cliniche e nei domini associati15. Le cellule epiteliali primarie sono un tipo di cellule specializzate che hanno passaggi limitati e una durata di vita più breve. Tuttavia, la crescita degli HMEC è stata ostacolata da vincoli tecnici, che hanno di conseguenza ostacolato i progressi della ricerca sul cancro al seno e su altre malattie infiam.......
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del programma di scienza e tecnologia TCM della provincia di Zhejiang, Cina (2017ZA055; 2018ZA036) e il progetto scientifico e tecnologico di Zunyi, provincia di Guizhou, Cina (Zunyi City Kehe Support NS (2020) n. 18) a X. Xu. Gli autori ringraziano il Laboratorio di Biologia Molecolare della Società di Tecnologia Biomedica Youjia (Hangzhou) per aver fornito formazione sulle colture cellulari.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.05% Trypsin | Basalmedia | K431010 | For HMECs dissociation |
1.5 mL microcentrifuge Tubes | NEST | 081722CK01 | For cell digestion |
100 µm mesh filter | Solarbio | 431752 | For HMECs filtration |
100 mm Cell Culture Dish | Corning | 430167 | For cell culture |
4% paraformaldehyde | solarbio | P1110-100ml | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | For cell centrifugation |
Cell Strainer | Solarbio | 431752 | Cell filtration |
Centrifuge | Eppendorf | 5404HN133048 | Cell centrifuge |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 42820906 | For cell incubation |
Collagenase Type I | Merck | SKU:SCR103 | For HMECs isolation |
Dispase | Solarbio | CAS:42613-33-2 | For HMECs isolation |
DMEM | Gibco | 8122622 | Component of neutralization medium |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 2556132P | Component of neutralization medium |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
Phosphate buffered solution | Tecono | 20201033 | Washing solution |
rabbit anti CK7 | abcam | ab68459 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
rabbit anti GATA3 | abcam | ab199428 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
Y-27632 | Solarbio | IY0040 | ROCK inhibitor |
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