Wir danken Regina Piske für die technische Unterstützung bei der Isolierung von Mikroglia und Dr. Caio Andreta Figueiredo für seine Hilfe bei der mikroskopischen Bildaufnahme in der ergänzenden Abbildung S1. Wir danken der FACS-Einrichtung des MDC für die technische Unterstützung. Dieses Manuskript stellt teilweise die repräsentativen Zahlen dar, die im Jahr 2024 beim Brain, Behavior and Immunity Journal eingereicht wurden. Abbildung 1A, Abbildung 2A und ergänzende Abbildung S3A wurden mit Hilfe von BioRender.com erstellt.

Eine allgemeine Darstellung des experimentellen Ablaufs ist in Abbildung 1A grafisch dargestellt. Alle Versuche mit lebenden Tieren, die zum Einsatz kamen, wurden unter strikter Einhaltung des deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt und vom Landesamt für Gesundheit und Soziales in Berlin (Berlin) genehmigt. Die Mäuse wurden in Gruppen in beatmeten Käfigen unter Standard-Laborbedingungen mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 Uhr in der Tierkernanlage des Max-Delbrück-Centrums für Molekulare Medizin (MDC) untergebracht. Nahrung und Wasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt.Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung der Puffer und Reagenzien und die Materialtabelle für Einzelheiten zu allen Reagenzien, Instrumenten und Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden. Für den vGLUT1-spezifischen Assay verwendeten wir den Begriff in vivo* im gesamten Manuskript, um anzuerkennen, dass die Durchflusszytometrie eine Gewebehomogenisierung und Zellisolierung erfordert und Mikroglia nach dem Isolierungsverfahren eine Lebensfähigkeit von etwa 95 % aufweisen (Abbildung 1B und ergänzende Abbildung S1). Daher behalten sie ihre Fähigkeit, synaptisches Material ex vivo für einen kurzen Zeitraum bis zur Fixierung zu verschlingen. Die Quantifizierung der vGLUT1+ -Mikroglia umfasst somit sowohl in vivo als auch kurzfristiges ex vivo Engulfment bis zum Fixierungsschritt.
1. Intrazelluläre vGLUT1-Färbung zum Nachweis einer in vivo* Verschlingung von glutamatergen Synapsen durch Mikroglia
HINWEIS: Das folgende Verfahren zur Zellisolierung wurde von16 übernommen. Alle Schritte der Zellisolierung sollten auf Eis durchgeführt werden.
<ol><li>Betäuben Sie die Mäuse mit intraperitonealer Injektion von Pentobarbital. Perfundieren Sie die Mäuse intrakardial mit 10 mL eiskalter Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) für ~2 min. HINWEIS: Pro Probe (n) wird eine Maus verwendet.</li>
	<li>Nehmen Sie das Gehirn aus dem Schädel und bewahren Sie es in 1 ml Nervenzellmedium auf. HINWEIS: Nervenzellmedium, wie z. B. Hibernate-A-Medium, wird verwendet, um eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Dissoziationsprozess des Gewebes zu gewährleisten.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gehirn in eine Petrischale, die mit 1 ml eiskaltem Nervenzellmedium gefüllt ist, und zerlegen Sie die Hippocampus, wie zuvor beschrieben17.</li>
	<li>Übertragen Sie die Hippocampi in einen Dounce-Homogenisator, der mit 1 ml Nervenzellmedium gefüllt ist, und dissoziieren Sie das Gewebe mit dem losen Stößel mit ca. ~25 sanften Strichen.</li>
	<li>Legen Sie ein 70-μm-Sieb auf ein 5-ml-Polypropylen-Röhrchen und fügen Sie 500 μl Nervenzellmedium hinzu. Übertragen Sie das Gewebehomogenat durch das Sieb in das 5 mL Polypropylen-Röhrchen.</li>
	<li>Spülen Sie den Dounce Homogenisator 2x mit 1 mL kaltem Nervenzellmedium und zentrifugieren Sie die Proben bei 400 × g für 8 min.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl eiskaltem DPBS durch sanftes Pipettieren. Stellen Sie eine homogene Suspension sicher und vervollständigen Sie das endgültige Volumen auf 1,5 mL durch Verwendung von DPBS.</li>
	<li>Geben Sie 500 μl isotonische Percoll-Lösung in die Probe, resuspendieren Sie sie vorsichtig und überlagern Sie sie mit weiteren 2 ml kaltem DPBS.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 3.000 × g für 10 Minuten bei voller Beschleunigung und ohne Bremse. In der mittleren Phase wird sowohl die oberste Schicht als auch die Myelinscheibe aspiriert. HINWEIS: Alle folgenden Zentrifugationsschritte werden, sofern nicht anders angegeben, bei 4 °C durchgeführt.</li>
	<li>Fügen Sie 4 mL kaltes DPBS hinzu und zentrifugieren Sie die Proben bei 400 × g für 10 Minuten. Der Überstand wird aspiriert und die Zellen werden in 100 μl fixierbarer Viabilitätsfärbelösung resuspendiert und die Proben 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert.</li>
	<li>Geben Sie 1 mL kaltes DPBS in die Probe und zentrifugieren Sie die Proben 5 Minuten lang bei 300 × g . Der Überstand wird verworfen und 100 μl CD16/CD32-Färbelösung (1/200 in FACS-Puffer) zugegeben. ~5 s vortexen und 10 min bei 4 °C inkubieren. HINWEIS: Die CD16/CD32-Färbung ist eine Vorbehandlung zur Minimierung der unspezifischen Bindung von Antikörpern an FcR-tragende Zellen, wie z. B. Mikroglia, vor Anwendungen wie der Durchflusszytometrie.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml FACS-Puffer in die Probe und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 × g . Den Überstand aspirieren und 100 μl Färbe-Mastermix-I (1/100 Anti-CD11b/ Anti-CD45 + 1/200 Anti-Ly6C/ Anti-Ly6G in 1x FACS-Puffer) zugeben. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml FACS-Puffer in die Probe und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 × g .</li>
	<li>Das Pellet wird in 250 μl Fixierpuffer resuspendiert. Bei 4 °C 25 min inkubieren.</li>
	<li>2 mL 1x Permeabilization (PERM) Puffer zugeben und 300 × g 5 min lang zentrifugieren.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen und 100 μl vGLUT1 oder Isotyp-Kontrollfärbelösung hinzufügen. ~5 s vortexen und die Proben 50 min lang bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL 1x PERM Puffer hinzu und zentrifugieren Sie 300 × g für 5 min. Der Überstand wird verworfen und 2 ml FACS-Puffer zu den Proben gegeben.</li>
	<li>Bei 300 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen in 250 μl FACS-Puffer und leiten Sie die Proben durch einen 40 μm Siebfilter.</li>
	<li>Analysieren Sie die vGLUT1-Fluoreszenzintensität von einzelnen/lebensfähigen/CD11b++/CD45+ Mikroglia mittels Durchflusszytometrie. Verwenden Sie Milzmakrophagen als Negativkontrolle für jedes Experiment.<ol><li>Isolieren Sie Splenozyten, indem Sie das zerkleinerte Milzgewebe zweimal sanft durch einen 70 μm Siebfilter komprimieren. Spülen Sie die Filter mit 40 mL DPBS und sammeln Sie die Suspension in einem konischen 50-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie 350 × g für 10 min und resuspendieren Sie das resultierende Pellet in einer 1 mL Lösung von Lysepuffer für rote Blutkörperchen. 10 min auf Eis inkubieren.</li>
		<li>Nach der Inkubation werden 10 ml DPBS in die Probe gegeben und 10 Minuten lang bei 350 × g zentrifugiert.</li>
		<li>Fahren Sie mit den Färbeschritten fort, die zwischen den Schritten 1.11 und 1.17 erläutert wurden. HINWEIS: Die Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt, um Milzmakrophagen als CD11b ++/ CD45 ++/ lebensfähige Zellpopulation zu definieren.</li>
		<li>Gating-Strategie (Abbildung 1)<ol><li>Primäres Gate: Passen Sie die vordere Streufläche (FSC-A) [x-Achse] und die seitliche Streufläche (SSC-A) [y-Achse] an, um die Mikroglia-Population in den Gated-Bereich einzubeziehen und die zellulären Trümmer auszuschließen.</li>
			<li>Passen Sie die Vorwärts-Streufläche (FSC-A) [x-Achse] und die Vorwärts-Streuhöhe (FSC-H) [y-Achse] an, um Dubletten auszuschließen. Singuletts werden in diesem Punktdiagramm als Diagonale angezeigt.</li>
			<li>Passen Sie CD11b-PECy7 [y-Achse] und CD45-APC [x-Achse] an und koppeln Sie die Population mit einem hohen Oberflächengehalt von CD11b und einem mittleren Gehalt an CD45 als Mikroglia.</li>
			<li>Schließen Sie tote Zellen im negativen Gatter FITC[y-Achse] aus. OPTIONAL: Schließen Sie auch Zellen aus, die positiv für Ly6C- und Ly6G-FITC sind, im FITC-negativen Gate, um ZNS-assoziierte Makrophagen von der Analyse auszuschließen. HINWEIS: Im Gegensatz zu lebenden Zellen ermöglichen tote Zellen mit kompromittierten Membranen das Eindringen des fixierbaren Viabilitätsfarbstoffs in das Zytoplasma, wodurch die Menge der Proteinmarkierung erhöhtwird 18. Somit sind tote Zellen heller als lebende Zellen, die im definierten Gate enthalten sind.</li>
			<li>Justierung von CD45-APC [x-Achse] und vGLUT1-PE [y-Achse]; Die Population, die sich über dem Schwellenwert befindet und in der keine positiven Ereignisse in der Milzprobe festgestellt wurden (interne biologische Negativkontrolle, Abbildung 1E), wird als vGLUT1-positive Fraktion in der Probe betrachtet.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Nachweis des in vitro Engulfments von rohen Synaptosomen durch Mikroglia
<ol><li>Rohes Synaptosomenpräparat und pHrodo Red-Markierung HINWEIS: Alle folgenden Schritte sollten auf Eis stattfinden.<ol><li>Führen Sie die Schritte 1.1 bis 1.2 aus.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gehirn in eine Petrischale, die mit 1 ml eiskaltem Nervenzellmedium gefüllt ist, und zerlegen Sie die Hippocampus vorsichtig. Bewahren Sie die Petrischale immer auf Eis auf. Verwenden Sie im nächsten Schritt Hippocampi zur Isolierung von Mikroglia.</li>
		<li>Übertragen Sie den Rest des Gehirns (mit Ausnahme des Kleinhirns und des Riechkolbens) in einen Dounce-Homogenisator, der mit 1 ml synaptischem Proteinextraktionsreagenz gefüllt ist, und dissoziieren Sie das Gewebe vorsichtig mit dem losen Stößel mit ca. ~30 Schlägen. Ergänzen Sie die eine Tablette Proteasehemmer pro 10 ml des Extraktionsreagenzes und isolieren Sie Synaptosomen gemäß den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Reagenzien zur Extraktion synaptischer Proteine, wie z. B. SynPER19, werden zur Herstellung von Synaptosomen verwendet, die biologisch aktive prä- und postsynaptische Proteine enthalten.</li>
		<li>Das rohe Synaptosomenpellet wird in 500 μl 0,1 M Na2CO3 -Lösung gelöst. Färben Sie die Synaptosomenprobe mit 10 μl 0,2 mM pHrodo Red. Inkubieren Sie die rohen Synaptosomenproben bei Raumtemperatur (24-25 °C) für 1,5 h unter leichtem Rühren.</li>
		<li>Geben Sie 1 ml kaltes DPBS auf die Probe, zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit (20.815 × g) und aspirieren Sie den Überstand.</li>
		<li>Schritt 2.1.5 wird insgesamt 7x wiederholt, um ungebundenes, überschüssiges pHrodo Red aus den Proben zu entfernen.</li>
		<li>Führen Sie nach der letzten Zentrifuge einen Standard-BCA-Assay durch, um die Proteinkonzentrationen der Probe zu quantifizieren.</li>
		<li>Optional: Synaptosomenproben in DPBS mit 5% DMSO unter Verwendung von flüssigem Stickstoff einfrieren und 3 Wochen bei -80 °C konservieren. Decken Sie die Röhren mit Alufolie ab, um die Lichteinwirkung so gering wie möglich zu halten.</li>
	</ol></li>
	<li>In vitro Roher Synaptosomen-Engulfment-Assay mit frisch isolierten adulten Mikroglia<ol><li>Bereiten Sie aCSF vor und äquilibrieren Sie es mit 95% O2:5% CO2 für 30 min. HINWEIS: Befolgen Sie für die Schritte 2.2.2 bis 2.2.4 die Anweisungen des Herstellers zur Herstellung von Verdauungslösung auf Papainbasis.</li>
		<li>Geben Sie 4 ml aCSF in die Durchstechflasche 2 des Papain-Kits. Stellen Sie das Fläschchen für ~10 min in ein 37 °C heißes Wasserbad, bis die Papainlösung klar erscheint.</li>
		<li>Geben Sie 400 μl aCSF in die Durchstechflasche 3 im Papain-Kit. Mischen Sie vorsichtig für ~10 Mal durch langsames Pipettieren.</li>
		<li>200 μl aus Durchstechflasche 3 in Durchstechflasche 2 geben (rekonstruiert in Schritt 2.2.3). Bewahren Sie den Rest des Fläschchens auf 3.</li>
		<li>Nehmen Sie die in Schritt 2.1.2 präparierten Hippocampus und zerkleinern Sie die präparierten Hippocampus mit einem Skalpell.</li>
		<li>Die zerkleinerten Hippocampi werden in ein Gewebedissoziatorröhrchen gegeben, das mit 2 ml Enzymlösung gefüllt ist, das in Schritt 2.2.5 hergestellt wurde. Setzen Sie den Schlauch in den Gewebedissoziator ein und führen Sie das Programm aus: 37C_ABDK_01 (dauert ~30 min).</li>
		<li>Legen Sie die Proben für ~20 min in ein Wasserbad bei 37 °C und zerkleinern Sie die Mischung alle 5 Minuten mit einer 1-ml-Pipette, ohne Blasen zu bilden. HINWEIS: Dieser Vorgang sollte so lange fortgesetzt werden, bis das Gewebe vollständig dissoziiert ist und vollständig homogen erscheint, um eine effiziente Dissoziation zu gewährleisten. Alle folgenden Zentrifugationsschritte werden, sofern nicht anders angegeben, bei 4 °C durchgeführt.</li>
		<li>Die Suspension der trüben Zellen vorsichtig in ein neues 15-ml-Röhrchen geben und 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugieren.</li>
		<li>Bereiten Sie während dieses Zeitraums von 5 Minuten die folgende Waschmischung (5 ml) pro Probe vor; 500 μl rekonstituierte Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung, die im Papain-Kit enthalten ist, zu 4,5 ml aCSF hinzufügen. Die restliche Lösung aus der Durchstechflasche 3 aus Schritt 2.2.5 wird der Waschmischung zugegeben.</li>
		<li>Der Überstand aus Schritt 2.2.8 ist zu verwerfen und das Zellpellet sofort wieder in der Waschmischlösung zu suspendieren.</li>
		<li>Geben Sie die Probe durch einen 70-μm-Filter in ein neues 5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Proben werden bei 300 × g 5 Minuten lang zentrifugiert.</li>
		<li>Fahren Sie mit dem zuvor in den Schritten 1.7-1.9 beschriebenen Schritt der Percoll-Gradientenzentrifugation fort.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in MACS-Färbepuffer, indem Sie langsam auf und ab pipettieren. Die Proben werden 15 Minuten lang bei 4 °C inkubiert.</li>
		<li>Geben Sie 1 ml MACS-Puffer zu jeder Probe und zentrifugieren Sie 8 Minuten lang bei 300 × g .</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl MACS-Puffer.</li>
		<li>Setzen Sie die positiven Selektionsspalten in den Magnetabscheider ein. Äquilibrieren Sie die Säulen, indem Sie sie mit 3 mL MACS-Puffer spülen.</li>
		<li>Mischen Sie vorsichtig und tragen Sie 500 μl der Zellsuspension auf die Säule auf. Waschen Sie die Säulen 3x mit 3 mL MACS Buffer.</li>
		<li>Nehmen Sie die Säulen aus dem Magnetabscheider und legen Sie sie auf konische 15-ml-Röhrchen. Geben Sie 5 mL MACS-Puffer auf die Säule und spülen Sie die Zellen sofort mit einem Plumper aus. Die Proben werden bei 300 × g 10 min lang zentrifugiert.</li>
		<li>Bereiten Sie während dieser Zeit 20 ml 40% FBS in DPBS vor. 1 ml DMEM pro Probe wird in einem Wasserbad auf bis zu 37 °C vorgewärmt.</li>
		<li>Lösen Sie das endgültige Zellpellet in 1 mL vorgewärmtem DMEM auf. Säen Sie etwa ~150.000-200.000 Zellen in 500 μl vorgewärmtem DMEM pro Well in einer 24-Well-Platte. Als Kontrolle säen Sie eine ähnliche Anzahl von Zellen in 1-2 zusätzliche Vertiefungen. Überprüfen Sie die Konfluenz der Zellen in allen Vertiefungen mit einem Lichtmikroskop. HINWEIS: Wenn es sich bei der Zielhirnregion um den Hippocampus oder vergleichbar kleine Hirnregionen handelt, können 5 Mäuse pro Probe (n) gepoolt werden, um ~150.000 Mikroglia zu isolieren. Für das gesamte Gehirn reicht 1 Maus pro n aus, um mit beiden Isolationsprotokollen eine ähnliche Anzahl von Zellen zu erhalten. Alternativ können ~40.000 Zellen in 96-Well-Platten mit einem Endvolumen von 100 μl plattiert werden, um den Engulfment-Assay zu starten. Dies reduziert die Anzahl der analysierten Zellen, aber auch die Anzahl der verwendeten Mäuse pro N. Proteinentzug aufgrund eines Mangels an FCS in DMEM löst Phagozytose aus.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte für 1-2 h im Inkubator (37 °C und 5 % CO2). HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, dass sich die Zellen vor Beginn des funktionellen Engulfment-Assays von den stressanfälligen Auswirkungen des Isolationsverfahrens erholen.</li>
		<li>Nehmen Sie sehr langsam 250 μl Medium aus jeder Vertiefung, geben Sie 250 μl frisch vorgewärmtes DMEM in jede Vertiefung und fügen Sie 3 μg pHRodo Red-markierte Synaptosomen auf die Oberseite hinzu. Überprüfen Sie die Zellkonfluenz in allen Vertiefungen mit einem Lichtmikroskop.<ol><li>Für die negativen Kontrollvertiefungen geben Sie die gleiche Menge an unmarkierten Synaptosomen in die zusätzliche Vertiefung, die mit Zellen besiedelt ist.</li>
			<li>Stellen Sie bei Testvertiefungen sicher, dass Vertiefung 1 nur Zellen enthält. Vertiefung 2 enthält Zellen + unmarkierte Synaptosomen; Well-3 enthält Zellen + 3 μg pHrodo Red; Vertiefung 4 enthält DMEM + 3 μg pHrodo Red.</li>
		</ol></li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen mit Synaptosomen für 2 h im Inkubator (37 °C und 5% CO2).</li>
		<li>Nehmen Sie das Medium heraus und waschen Sie die Vertiefungen mit kaltem DPBS. Fügen Sie 200 μl Trypsin/EDTA-Lösung pro Vertiefung hinzu, um die Zellen 35 s lang zu lösen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml 40 % FBS in DPBS pro Vertiefung hinzu und übertragen Sie die Zellen durch das Sieb in ein 5-ml-Polypropylenröhrchen. Halten Sie sowohl die Platte als auch das Röhrchen während dieses Vorgangs auf Eis, um die Ablösung der Zellen zu erleichtern.</li>
		<li>Waschen Sie jede Vertiefung 2x mit 500 μl eiskaltem DPBS. Zentrifugieren Sie die gesammelten Proben bei 500 × g für 5 min.</li>
		<li>Die Zellen werden in der Färbelösung, die 1/200 CD16/CD32 enthält, in 100 μl FACS-Puffer resuspendiert und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert.</li>
		<li>Nach der Inkubation werden CD11b und CD45 mit einer Endkonzentration von jeweils 1/100 zur Färbelösung gegeben. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln.</li>
		<li>Waschen Sie die Proben mit 1 mL FACS-Puffer und zentrifugieren Sie sie bei 300 × g für 10 min.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 250 μl FACS-Puffer und zeichnen Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie insgesamt mindestens 100.000 Ereignisse auf. Analysieren Sie die pHrodo-Red-Fluoreszenzintensität von CD11b++/CD45+ -Mikroglia.</li>
		<li>Gating-Strategie (Abbildung 2C)<ol><li>Passen Sie das primäre Gate an: Forward Scatter Area (FSC-A) [x-Achse] und Side Scatter Area (SSC-A) [x-Achse], um die Mikrogliapopulation in den Gated-Bereich einzubeziehen und die zellulären Trümmer auszuschließen.</li>
			<li>Passen Sie die Vorwärts-Streufläche (FSC-A) [x-Achse] und die Vorwärts-Streuhöhe (FSC-H) [y-Achse] an, um Dubletten auszuschließen. Singuletts werden in diesem Punktdiagramm als Diagonale angezeigt.</li>
			<li>Passen Sie CD11b-PECy7 [y-Achse] und CD45-APC [x-Achse] an und koppeln Sie die Population mit hohem Oberflächenniveau von CD11b und mittlerem Niveau von CD45 als Mikroglia.</li>
			<li>Berechnen Sie die mediane Fluoreszenzintensität von pHrodo-PE aus dieser Population. Verwenden Sie die gleichen Zellen, die mit unmarkierten Synaptosomen inkubiert wurden, als Negativkontrolle.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Durchflusszytometrie-basierte Assays für das mikrogliale Engulfment von synaptischen Materialien

<ol>
	<li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+physiology+and+Disease.">Microglia in physiology and Disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li><li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+integrity+and+complement+control+synaptic+material+clearance+by+microglia+after+CNS+injury.">Neuronal integrity and complement control synaptic material clearance by microglia after CNS injury.</a> JEM. 215 (7), 1789-1801 (2018).</li><li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations.">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 7944 (2020).</li><li>Jaszczyk, A., Stankiewicz, A. M., Juszczak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+mouse+hippocampus+with+its+dorsal,+intermediate+and+ventral+subdivisions+combined+with+molecular+validation.">Dissection of mouse hippocampus with its dorsal, intermediate and ventral subdivisions combined with molecular validation.</a> Brain Sci. 12 (6), 799 (2022).</li><li>Fixable viability dyes for flow cytometry. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html</a> (2024)</li><li>SynPER synaptic protein extraction reagent. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P</a> (2024)</li><li>Wu, A., Yu, B., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+olfactory+bulb+circuits.">Plasticity in olfactory bulb circuits.</a> Curr Opin Neurol. 64, 17-23 (2020).</li><li>pHrodo indicators for pH determination. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html</a> (2024)</li><li>Rangaraju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phagocytic+properties+of+CD45low+microglia+and+CD45high+brain+mononuclear+phagocytes-activation+and+age-related+effects.">Differential phagocytic properties of CD45low microglia and CD45high brain mononuclear phagocytes-activation and age-related effects.</a> Front Immunol. 9, 405 (2018).</li><li>Weinhard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+remodel+synapses+by+presynaptic+trogocytosis+and+spine+head+filopodia+induction.">Microglia remodel synapses by presynaptic trogocytosis and spine head filopodia induction.</a> Nat Commun. 9 (1), 1228 (2018).</li><li>Morizawa, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+through+glial+synapse+engulfment+upon+motor+learning.">Synaptic pruning through glial synapse engulfment upon motor learning.</a> Nat Neurosci. 25 (11), 1458-1469 (2022).</li><li>Morini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+studying+microglial-mediated+synapse+elimination+and+refinement.">Strategies and tools for studying microglial-mediated synapse elimination and refinement.</a> Front. Immunol. 12, 640937 (2021).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry. Part A: J. Int Soc Anal Cytol. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>. Strategies for intracellular flow cytometry success Available from: <a target="_blank" href="https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/">https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/</a> (2022)</li><li>. Isotype control antibodies, Key points Available from: <a target="_blank" href="https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used">https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used</a> (2024)</li><li>Flow cytometry intracellular staining controls. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html</a> (2024)</li><li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEAST:+A+flow+cytometry-based+toolkit+for+interrogating+microglial+engulfment+of+synaptic+and+myelin+proteins.">FEAST: A flow cytometry-based toolkit for interrogating microglial engulfment of synaptic and myelin proteins.</a> Nat Commun. 14, 6015 (2023).</li><li>Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+general+and+discriminating+markers+of+differential+microglia+phenotypes.">Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes.</a> Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).</li><li>van Wageningen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microglial+TMEM119+and+P2RY12+immunoreactivity+in+multiple+sclerosis+white+and+grey+matter+lesions+is+dependent+on+their+inflammatory+environment.">Regulation of microglial TMEM119 and P2RY12 immunoreactivity in multiple sclerosis white and grey matter lesions is dependent on their inflammatory environment.</a> Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 206 (2019).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Die synaptische Verfeinerung durch Mikroglia-Synapsen-Interaktion ist ein faszinierendes Forschungsgebiet innerhalb der Neuroimmunologie, das vielversprechende Einblicke in die Rolle von Mikroglia bei neurodegenerativen und neurologischen Entwicklungsstörungen bietet. Im Jahr 2011; Paolicelli et al. lieferten Hinweise auf das Vorhandensein von synaptischem Material in Mikroglia und gaben Aufschluss darüber, wie sie am Prozess des synaptischen Engulfments beteiligt sind4. Eine weitere faszinierende Studie verwendete Zeitraffer-Bildgebung und ein ex vivo organotypisches Hirnschnittkulturmodell und berichtete, dass Mikroglia an einem phagozytären Prozess teilnehmen, der als Trogozytose bekannt ist, bei dem sie präsynaptische Strukturen und nicht die gesamte synaptische Struktur verschlingen23. Eine sehr aktuelle Veröffentlichung mit einem neuen transgenen Mausmodell, das die Messung der Phagozytose in intaktem Gewebe ermöglicht, zeigte die Beschneidung durch Bergmann-Gliazellen in vivo nach motorischem Lernen24. Somit gibt es genügend Hinweise auf die Beteiligung von Gliazellen am synaptischen Engulfment, einschließlich der Mikroglia. Das Ausmaß, in dem diese Mikrogliafunktion den dynamischen und selektiven Prozess der synaptischen Beschneidung beeinflusst, erfordert jedoch weitere Nachweise.
Nichtsdestotrotz dient die Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von Synapsen als wertvoller Indikator und bietet einen teilweisen Einblick in die komplexe Dynamik von Mikroglia-Synapsen-Interaktionen, insbesondere der synaptischen Verfeinerung. Eine umfassende Übersichtsarbeit hat die aktuellen Protokolle zur Untersuchung des Mikroglia-Engulfments von Synapsen zusammengefasst25. Wir möchten betonen, dass unsere Protokolle auf der Grundlage bestehender Protokolle optimiert sind, die bereits im Einsatz sind. Die in dieser Studie vorgestellten Methoden ermöglichen eine schnelle und hohe Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von Synapsen in verschiedenen präparierten Hirnregionen. Je nach Hirnregion ist für beide Methoden eine Analyse von mindestens 10.000 Mikrogliazellen in maximal zwei Tagen möglich, was sie für die parallele Testung mehrerer Mausmodelle wertvoll macht.
Wir erkennen an, dass die Quantifizierung von vGLUT1+ -Mikroglia sowohl in vivo als auch kurzfristiges ex vivo Engulfment bis zum Fixierungsschritt umfasst. Daher schlagen wir vor, dass unser Assay eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit zur Quantifizierung von synaptischem Material in Mikroglia darstellt, als ersten Schritt vor der In-vivo-Validierung mit Ansätzen wie IHC.
Ein weiterer Nachteil der durchflusszytometrischen Analyse ist die eingeschränkte Verfügbarkeit von Antikörpern für synaptische Marker, insbesondere für inhibitorische Synapsen. Es ist schwierig, kommerziell verfügbare, direkt konjugierte Antikörper zu finden, die ein helles Signal für diese Marker zeigen. Angesichts der umfangreichen Optimierungszeit, die erforderlich ist, um verschiedene Antikörper zu testen, die auf synaptische Marker abzielen, ist es wichtig, die gut optimierten Verfahren für die intrazelluläre Färbung mit verschiedenen Antikörpern mit der wissenschaftlichen Gemeinschaft zu teilen, wie wir es hier mit dieser Studie tun.
In Bezug auf die Datenanalyse in dieser Studie haben wir Isotypkontrollen als technische Negativkontrollen verwendet, um unspezifische Bindungen des vGLUT1-Antikörpers zu berücksichtigen, da sie eine Schätzung für die unspezifische Bindung eines Antikörpers in einer Probe liefern und gleichzeitig durchflusszytometrische Assays optimieren26. Isotypkontrollen wurden jedoch größtenteils für die Detektion des unspezifischen Hintergrundsignals aus den Oberflächenfärbeverfahren optimiert und sind für intrazelluläre Färbekontrollen nicht optimal27,28. Daher sollte man sich nicht darauf verlassen, dass sie bei der intrazellulären Färbung zwischen der negativen und der positiven Population unterscheiden, die Fixierungs- und Permeabilisierungsschritte umfasst, die sich auf den Antigennachweis, die Autofluoreszenz und die Fluorophorhelligkeit auswirken können29. Solche intrazellulären Färbeverfahren erfordern die Verwendung geeigneter biologischer interner Kontrollen, um die positive Zellpopulation zu definieren, die für einen intrazellulären Marker gefärbt wurde29. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass wir ein intrazelluläres Färbeprotokoll verwenden, verwendeten wir eine interne biologische Negativkontrolle (Milzmakrophagen) und definierten die Grenze zwischen der positiven und der negativen Population anhand der Milzmakrophagen, die von denselben Mäusen isoliert wurden. Wir unterschieden die positive Population oberhalb des Gates, an der es keine vGLUT1-positiven Ereignisse gibt, von den Milzmakrophagen, die als biologische Negativkontrolle dienen (Abbildung 1).
Beide Methoden, die in dieser Studie vorgestellt werden, bieten ein großes Potenzial für die erste Analyse des Mikroglia-Engulfments von Synapsen in einer schnellen und hohen Durchsatzweise, indem über 10.000 Zellen aus kleinen Hirnregionen analysiert werden, was mit Standard-Mikroskopietechniken nicht möglich ist. Daher bieten diese Methoden einen signifikanten Vorteil gegenüber arbeits- und zeitintensiven Methoden und bieten darüber hinaus eine umfassendere Analyse des synaptischen Engulfments, indem sie eine Analyse einer größeren Anzahl von Mikroglia ermöglichen. Darüber hinaus ist die in dieser Studie vorgestellte in vitro-Methode besonders nützlich, um den Einfluss verschiedener Behandlungen auf das Mikroglia-Engulfment von Synapsen zu testen. Es ermöglicht die direkte Quantifizierung der Wirkung der Behandlung auf Mikroglia ohne die Störfaktoren, die mit anderen Zelltypen verbunden sind. Darüber hinaus dient es als indirekter Ansatz, um einen möglichen Einfluss der Mikroumgebung oder anderer Zelltypen auf den Prozess des synaptischen Engulfments nachzuweisen. Daher schließen wir, dass diese Methoden, insbesondere wenn sie parallel eingesetzt werden, intuitive und vorteilhafte Alternativen für die Analyse des Mikroglia-Engulfments von synaptischen Materialien bieten.
Die Analyse frisch isolierter Mikroglia mittels FACS-basierter phagozytärer Assays ex vivo kann jedoch einige Nachteile mit sich bringen. Erstens ist es entscheidend, gut optimierte Protokolle zu verwenden, die frisch isolierte Mikroglia aus dem erwachsenen Gehirn erzeugen und gleichzeitig die Ex-vivo-Aktivierung und Stressreaktion von Mikroglia vermeiden. Dissing-Olesen et al. verwendeten transkriptionelle und translationale Inhibitoren, um dieses Problem zu lösen, indem sie ein Gewebedissoziationsverfahren bei 37 °C30 anwandten. Mattei et al. hingegen präsentierten ein kaltes, mechanisches Gewebedissoziationsprotokoll, um die Induktion der ex vivo-Expression von stressassoziierten Genenzu vermeiden 16 , und wir passten dieses Protokoll im ersten Abschnitt an, um eine ex vivo Aktivierung der stressassoziierten Mikroglia-Reaktion vor der intrazellulären vGLUT1-Färbung zu vermeiden. Wir verwendeten ein enzymatisches Gewebedissoziationsprotokoll im zweiten Abschnitt vor dem in vitro Synaptosomen-Engulfment-Assay unter Berücksichtigung der höheren Ausbeute an Mikroglia nach Papain-basierter Gewebedissoziation (Daten nicht gezeigt). Mikroglia verbleiben unter Kulturbedingungen unvermeidlich bei 37 °C, wenn sie mit Synaptosomen inkubiert werden, und eine Inkubation bei 37 °C kann in der Tat Veränderungen in den Mikroglia induzieren, was ein häufiger Nachteil aller In-vitro-Assays und Zellkulturverfahren ist. Daher schlagen wir vor, beide vorgestellten Protokolle parallel zu verwenden, um zu einer breiteren Schlussfolgerung in Bezug auf das Mikroglia-Engulfment von Synapsen zu gelangen.
Darüber hinaus ist es wichtig, die Gating-Strategie zur Selektion von CD11b++/CD45+ -Mikroglia sorgfältig zu definieren, indem das Vorhandensein anderer Immunzellen im Hirnparenchym berücksichtigt wird, die diese Marker ebenfalls exprimieren31. Noch wichtiger ist, dass es bei der Auswahl von Markern, die spezifisch auf Mikroglia abzielen (z. B. TMEM119, P2RY12), wichtig ist zu berücksichtigen, dass sie während pathologischer und entzündlicher Zustände Veränderungen in ihrem Expressionsniveau erfahren können32, und solche Veränderungen sollten vor der Einrichtung des FACS-Gremiums zur Quantifizierung des Mikroglia-Engulfments von Synapsen berücksichtigt werden. Abschließend ist es wichtig zu betonen, dass keine der zuvor diskutierten Methoden, einschließlich der IHC- und mikroskopiebasierten in vivo-Ansätze , allein das aktive und selektive Beschneiden von Synapsen durch Mikroglia erfassen kann. Diese Methoden sind nicht in der Lage, die aktive Beschneidung durch Mikroglia von der passiven Beschneidung von synaptischen Trümmern innerhalb des Hirnparenchyms zu unterscheiden. Daher ist es bei der Auswertung und Diskussion der Daten unerlässlich, klar zwischen diesen unterschiedlichen Konzepten zu unterscheiden.

Mikroglia sind die residenten Immunzellen des Zentralnervensystems (ZNS)1. Sie scannen ständig ihre Mikroumgebung und sorgen für Überwachung 1,2. Darüber hinaus interagieren sie häufig mit Synapsen und vermitteln eine Feinabstimmung der synaptischen Aktivität3. So haben sie sich zu einem wichtigen Akteur im Prozess der synaptischen Verfeinerung entwickelt.
Die Rolle der Mikroglia bei der synaptischen Verfeinerung durch die Verschlingung von Synapsen wurde von verschiedenen Forschungsgruppengezeigt 3,4,5,6,7. Störungen in diesem Prozess können zur Pathologie von neurologischen Entwicklungsstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen wie Schizophrenie und Alzheimer beitragen8. Eine aberrante synaptische Verfeinerung durch Mikroglia wurde bereits in verschiedenen Mausmodellen neurologischer Erkrankungen nachgewiesen 5,9,10. Daher ist die Identifizierung unterschiedlicher Mechanismen, die dem Mikroglia-Engulfment von Synapsen zugrunde liegen, von größter Bedeutung für das Verständnis der Pathophysiologie von neurologischen Entwicklungsstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen8.
Die gezielte Engulfmentierung von Synapsen in den Mikroglia birgt ein großes Potenzial, um sowohl in das Fortschreiten der Krankheit einzugreifen als auch Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen von neurologischen Entwicklungsstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen zu gewinnen. Um solche Untersuchungen zu erleichtern, sind schnelle Ansätze mit hohem Durchsatz erforderlich. Aktuelle methodische Ansätze umfassen in vivo-, ex vivo- und in vitro-Assays, die den Nachweis von synaptischem Material innerhalb von Mikroglia ermöglichen. Im Allgemeinen stützt sich der Nachweis des Mikroglia-Engulfments von Synapsen stark auf immunhistochemische (IHC) und mikroskopiebasierte Ansätze 5,6,11, die arbeitsintensiv sind und Einschränkungen bei der Analyse einer großen Anzahl von Mikroglia aufweisen.
Angesichts dieser technischen Einschränkungen ist die Erforschung alternativer Methoden unerlässlich. Um dies zu überwinden, haben wir einen auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatz optimiert, der eine effiziente, unvoreingenommene und hochdurchsatzbasierte Analyse des Mikroglia-Engulfments von Synapsen ermöglicht. Wir haben den Hippocampus aufgrund seines hohen Grades an synaptischem Umbau und Plastizität als Hauptregion von Interesse gewählt12, aber das Protokoll kann an verschiedene Hirnregionen angepasst werden. Während die Durchflusszytometrie bereits in früheren Studien zum Nachweis des Mikroglia-Engulfments der Synapsen 13,14,15 eingesetzt wurde, stellen wir hier eine Schritt-für-Schritt-Methodik unter Verwendung eines derzeit kommerziell erhältlichen, Fluorophor-konjugierten vGLUT1-Antikörpers zur Verfügung. Darüber hinaus bieten wir einen ergänzenden in vitro Ansatz für das Hochdurchsatz-Screening des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material unter Verwendung von rohen Synaptosomen an.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Dounce Homogenizer</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>Cat# 40401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat# 0030119452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11b</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 559864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6C</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 553104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 551460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Cat# 23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32 Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#14-0161-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixable viability dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# L34969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# A1247501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS-columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>Cat# 17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11339283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodoRed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>Cat# 5892970001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat# 11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop E-GP Sterile Filtration System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# SEGPT0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynPer Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 87793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGLUT1 Antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-120-764</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of microglial engulfment of synaptic material using flow cytometry

Mikroglia spielen eine zentrale Rolle bei der synaptischen Verfeinerung im Gehirn. Die Analyse der Mikroglia-Verschlingung von Synapsen ist für das Verständnis dieses Prozesses unerlässlich; Die derzeit verfügbaren Methoden zur Identifizierung des Mikroglia-Engulfments von Synapsen, wie die Immunhistochemie (IHC) und die Bildgebung, sind jedoch aufwändig und zeitintensiv. Um dieser Herausforderung zu begegnen, stellen wir hier in vitro und in vivo* Assays vor, die eine schnelle und hohe Durchsatzquantifizierung des Mikroglia-Engulfments von Synapsen mittels Durchflusszytometrie ermöglichen.
Im in vivo* -Ansatz führten wir eine intrazelluläre vGLUT1-Färbung nach der Isolierung frischer Zellen aus adulten Mausgehirnen durch, um die Verschlingung von vGLUT1+ -Synapsen durch Mikroglia zu quantifizieren. Im in vitro Synaptosomen-Engulfment-Assay verwendeten wir frisch isolierte Zellen aus dem adulten Mausgehirn, um den Engulfment von pHrodo Red markierten Synaptosomen durch Mikroglia zu quantifizieren. Zusammen bieten diese Protokolle einen zeiteffizienten Ansatz zur Quantifizierung des Mikroglia-Engulfments von Synapsen und stellen vielversprechende Alternativen zu arbeitsintensiven bildanalysebasierten Methoden dar. Durch die Rationalisierung der Analyse können diese Assays zu einem besseren Verständnis der Rolle von Mikroglia bei der synaptischen Verfeinerung in verschiedenen Krankheitsmodellen beitragen.

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS)1. They constantly scan their microenvironment and provide surveillance1,2. Moreover, they frequently interact with synapses and mediate a fine-tuning of the synaptic activity3. Thus, they have emerged as a key player in the process of synaptic refinement.
The role of microglia in synaptic refinement through the engulfment of synapses has been shown by various research groups3,4,5,6,7. Disruptions in this process can contribute to the pathology of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders such as schizophrenia and Alzheimer&#39;s disease8. Aberrant synaptic refinement by microglia has already been detected in various murine models of neurological disorders5,9,10. Therefore, identification of distinct mechanisms underlying microglial engulfment of synapses is paramount to understanding the pathophysiology of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders8.
Targeting microglial engulfment of synapses holds great potential for both intervening in disease progression and gaining insights into the underlying mechanisms of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. To facilitate such investigations, there is a need for fast and high-throughput approaches. Current methodological approaches encompass in vivo, ex vivo, and in vitro assays that enable the detection of synaptic material within microglia. Generally, the detection of microglial engulfment of synapses relies heavily on immunohistochemistry (IHC) and microscopy-based approaches5,6,11, which are labor-intensive and show limitations in analyzing a large number of microglia.
Given these technical limitations, the exploration of alternative methodologies is imperative. To overcome this, we have optimized a flow cytometry-based approach, which enables an efficient, unbiased, and high-throughput analysis of microglial engulfment of synapses. We chose the hippocampus as the main region of interest due to its high degree of synaptic remodeling and plasticity12, but the protocol can be adapted to various brain regions. While flow cytometry has already been used in previous studies to detect microglial engulfment of synapses13,14,15, we herein provide a step-by-step methodology employing a currently commercially available, fluorophore-conjugated vGLUT1 antibody. We, moreover, provide a complementary&#160;in vitro approach for high-throughput screening of microglial engulfment of synaptic material by using crude synaptosomes.

Autor im Rampenlicht: Förderung des Verständnisses durch technologische Innovationen in der Psychoneuroimmunologie

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Our research focus is on psychoneuroimmunology and we investigate the crosstalk of the immune system with the brain and the mind. I'm particularly interested in deciphering subgroups of patients based on their immune status to find tailored treatments for them. Recent developments in our field include, for instance, the development of PET ligands, but also include advanced technologies such as RNA sequencing, single cell RNA sequencing, and spatial RNA sequencing to decipher immune-based therapies.Our protocol addresses the challenge of quantifying microglial engulfment of synaptic material, which is crucial to understand the role in brain function as well as in disease pathology. Our protocol offers a fast and reliable quantification of engulfed synaptic material by microglia, and therefore provides insights into functional activity of microglia. Our protocol will inspire other research groups to include more functional assays in their research, such as engulfed motosynaptosomes, and this will lead a better and more comprehensive understanding of the role of microglia in neuroimmune interactions.

In diesem Projekt haben wir zwei Protokolle zur Messung des in vivo* und in vitro Engulfments von Synapsen durch Mikroglia optimiert und vorgestellt. Im ersten Protokoll konzentrierten wir uns auf das in vivo* Engulfment von vGLUT1-positiven Synapsen. Als Ausgangspunkt haben wir ein zuvor veröffentlichtes Protokoll14 verwendet. Die in diesem Protokoll verwendeten FACS-Antikörper werden jedoch abgesetzt und wir haben viele Optimierungsschritte sowie eine neuartige Methode zur Isolierung von Mikroglia hinzugefügt16. Aus diesem Grund lohnt es sich, das hier vorgestellte Protokoll als umfassende Aktualisierung der bereits veröffentlichten Protokolle mit der wissenschaftlichen Gemeinschaft zu teilen.
Um die Mikroglia-Verschlingung von Synapsen zu quantifizieren, verwendeten wir männliche C57BL/6N-Mäuse im Alter von 11-14 Wochen. Der Hippocampus wurde aufgrund seines hohen Grades an synaptischem Umbau und Plastizität als Hauptregion von Interesse ausgewählt12. Wir analysierten sowohl %vGLUT1-positive Mikroglia als auch Mikroglia-spezifische vGLUT1-PE-Fluoreszenzintensität (MFI) im Hippocampus von C57BL/6N-Mäusen. Milzmakrophagen, die von denselben Tieren stammten, wurden als biologische Negativkontrolle pro Versuch verwendet. Wir testeten den vGLUT1-Antikörper, indem wir ein höheres vGLUT1-PE-Fluoreszenzsignal von den hippokampalen Mikroglia im Vergleich zur Isotypkontrolle und den Milzmakrophagen zeigten (Abbildung 1B-E)
Darüber hinaus verglichen wir die mikrogliale Verschlingung von Synapsen im Kleinhirn sowie im Riechkolben (als weitere Referenz für eine hohe synaptische Plastizität)20. Wir fanden ein höheres vGLUT1-Fluoreszenzsignal in den Mikroglia des Riechkolbens und ein niedrigeres Signal im Kleinhirn im Vergleich zum Hippocampus (Abbildung 1F). Die geringste Signalintensität wurde in den Milzmakrophagen nachgewiesen, die als interne Negativkontrolle dienen (Abbildung 1E). Zusätzlich verwendeten wir Vglut-IRES-Cre/ChR2-YFP-Mäuse, um die Immunreaktivität unseres vGLUT1-Antikörpers zu testen. YFP wird von den glutamatergen Neuronen dieser Mäuse exprimiert, was darauf hindeutet, dass die YFP-positive Population auch eine vGLUT1-positive Fraktion enthalten sollte. Mit Hilfe dieses Färbeprotokolls konnten wir 98,7 % der YFP-positiven Population als vGLUT1-positiv nachweisen, was die Effizienz unseres Antikörpers bestätigt (Ergänzende Abbildung S3).
Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse die Wirksamkeit des vGLUT1-Antikörpers und des vorgestellten Färbeprotokolls. Wir zeigen, dass dieses Protokoll und der Antikörper sicher verwendet werden können, um das In-vivo*-Engulfment von Synapsen im Vergleich zu anderen experimentellen Ansätzen mit hohem Durchsatz und schnell zu quantifizieren.
Im Anschluss an die In-vitro-Methode isolierten wir adulte Mikroglia und inkubierten sie mit frisch isolierten pHrodo Red-markierten Synaptosomen, die von denselben Tieren isoliert wurden, um ihr In-vitro-Engulfment zu quantifizieren (Abbildung 2A). Wir haben Synaptosomen mit pHrodo Red markiert, das das Fluoreszenzsignal in saurer Umgebung vonpH 21 auf natürliche Weise erhöht. Wir haben Synaptosomen frisch isoliert und unterschiedlichen pH-Werten (pH = 4 und pH = 11) ausgesetzt. Nachdem wir den Anstieg des Fluoreszenzsignals bei niedrigem pH-Wert als Proof-of-Principle-Experiment bestätigt hatten (Abbildung 2B), inkubierten wir diese Synaptosomen mit frisch isolierten Mikroglia für 1,5-2 Stunden. Als Kontrolle inkubierten wir Mikroglia mit unmarkierten Synaptosomen. Als nächstes analysierten wir das pHrodo Red-PE-Fluoreszenzsignal von CD11b++/CD45+ Mikroglia und beobachteten eine positive PE-Fluoreszenz, die mit der von Synaptosomen bei pH = 4 vergleichbar war (Abbildung 2C). Somit ermöglicht diese Methode eine schnelle und hohe Durchsatzanalyse des in vitro Engulfments von Synaptosomen und kann nach notwendigen Optimierungsschritten auf Amyloid-Plaques oder das Engulfment anderer potenzieller Ziele ausgeweitet werden. In der Tat quantifizierten Rangaraju et al. die Verschlingung von Amyloid-Beta durch Mikroglia unter Verwendung eines ähnlichen, auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatzes22. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese beiden Methoden eine robuste, effiziente und hochdurchsatzstarke Quantifizierung des Mikroglia-Engulfments von Synapsen sowohl in vivo* als auch in vitro ermöglichen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig01v4.jpg"> Abbildung 1: Analyse des Mikroglia-Engulfments von vGLUT1+ -Synapsen in vivo*. (A) Grafische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs, der die Schritte der intrazellulären vGLUT1-Färbung darstellt. (B) Gating-Strategie zur Definition einer einzelnen/CD11b++/CD45+/ lebensfähigen Zellpopulation aus dem Hippocampus. Diese Population wurde zur Analyse von vGLUT1-MFI sowie zur Quantifizierung des Prozentsatzes von vGLUT1+ -Mikroglia im Hippocampus verwendet. Das mit dem roten Rechteck dargestellte Gate zeigt den vGLUT1+ -Zellanteil in der Gesamtprobe an. (C) Das Histogramm zeigt die Fluoreszenzintensität von vGLUT1-PE an. (D) Das mit dem roten Rechteck dargestellte Gate zeigt an, dass es keine positive Zellfraktion gibt, die eine Isotyp-PE-Immunreaktivität aufweist. Das Histogramm zeigt die Isotyp-PE-Fluoreszenzintensität an. (E) Das mit dem roten Rechteck gezeigte Gate zeigt keine positive Zellfraktion an, die eine vGLUT1-PE-Immunreaktivität in den Milzmakrophagen zeigt. Das Histogramm zeigt die Fluoreszenzintensität von vGLUT1-PE an. Das im Histogramm angegebene Gate beginnt auf der Ebene, auf der der vGLUT1-MFI aus der Milz endet (~104) und wird zur Analyse der vGLUT1-positiven Fraktion in den Gehirnproben verwendet. (F) Das überlagerte Histogramm zeigt den Vergleich der PE-Fluoreszenzintensität von Milzmakrophagen (grau) und Mikroglia aus dem Hippocampus (rot), dem Kleinhirn (violett) und dem Riechkolben (hellblau). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig02.jpg"> Abbildung 2: Analyse des Mikroglia-Engulfments von Synaptosomen-Synapsen in vitro. (A) Grafische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs mit den Schritten des in vitro Synaptosomen-Engulfment-Assays. (B) Synaptosomen, die bei zwei verschiedenen pH-Werten inkubiert wurden, zeigen ein niedriges pHrodo-Red-PE-Fluoreszenzsignal bei pH = 11 und eine hohe pHrodoRed-PE-Fluoreszenz bei pH = 4. (C) Die Einzel-/CD11b++/CD45+ -Zellpopulation wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität von pHrodo Red-PE zu analysieren. Mikroglia, die mit ungefärbten Synaptosomen inkubiert wurden, wurden als Negativkontrolle verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Liste der in diesem Protokoll verwendeten Puffer und Reagenzien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_table%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Repräsentatives Bild frisch isolierter adulter Mikroglia. Das Bild wurde mit einem Lichtmikroskop mit 20-fachem Objektiv nach dem Papain-basierten Gewebedissoziationsprotokoll und der MACS-basierten Isolierung von CD11b+-Mikroglia aufgenommen. Maßstabsleiste = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-1.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S2: Repräsentative FACS-Diagramme, die die Gating-Strategie zur Definition von Milzmakrophagen demonstrieren. Milz wurde als Negativkontrolle in den Experimenten pro Versuchslauf verwendet, während das Mikroglia-Engulfment von Synapsen im Hippocampus getestet wurde. Die oben angegebenen FACS-Diagramme definieren die Milzmakrophagen als CD11b++/CD45++/lebensfähige Population. Diese Population wurde verwendet, um einen Schwellenwert zur Quantifizierung von vGLUT1+- Mikroglia in den Gehirnproben festzulegen, die sich oberhalb dieses Schwellenwerts befinden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-2.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S3: Repräsentative FACS-Diagramme, die die Gating-Strategie zum Testen der Effizienz des vGLUT1-Antikörpers demonstrieren. (A) Grafische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs, der die Schritte der vGLUT1-Färbung darstellt. YFP+ glutamaterge Neuronen wurden verwendet, um die Immunreaktivität des vGLUT1-Antikörpers zu testen. (B) Gating-Strategie zur Definition der YFP+ -Population aus dem Hippocampus von Vglut-IRES-Cre//ChR2-YFP-Mäusen, die als Positivkontrolle zum Testen der Effizienz des vGLUT1-FACS-Antikörpers verwendet wurden. Die YFP+ -Fraktion wurde gegated, um glutamaterge Synapsen zu spezifizieren. In dieser Population wurde die Immunreaktivität des vGLUT1-Antikörpers analysiert, um die Immunreaktivität des Antikörpers zu testen. Im Vergleich zur (C)-Isotyp-Kontrolle; 97,9% der YFP-positiven Zellfraktion wird als (D) vGLUT1-positiv nachgewiesen. (E) Das überlagerte Histogramm zeigt den Vergleich der PE-Fluoreszenz zwischen dem Isotyp und dem vGLUT1-Antikörper. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-3.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Hier stellen wir zwei Protokolle zur Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von vGLUT1-positiven Synapsen und pHRodo Red markierten rohen Synaptosomen mittels Durchflusszytometrie vor.

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Unser Forschungsschwerpunkt liegt in der Psychoneuroimmunologie und wir untersuchen die Wechselwirkung des Immunsystems mit dem Gehirn und dem Verstand. Ich interessiere mich besonders dafür, Untergruppen von Patienten anhand ihres Immunstatus zu entschlüsseln, um maßgeschneiderte Behandlungen für sie zu finden. Zu den jüngsten Entwicklungen in unserem Bereich gehören beispielsweise die Entwicklung von PET-Liganden, aber auch fortschrittliche Technologien wie RNA-Sequenzierung, Einzelzell-RNA-Sequenzierung und räumliche RNA-Sequenzierung zur Entschlüsselung immunbasierter Therapien.Unser Protokoll befasst sich mit der Herausforderung der Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material, was für das Verständnis der Rolle in der Gehirnfunktion sowie in der Krankheitspathologie von entscheidender Bedeutung ist. Unser Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Quantifizierung des verschlungenen synaptischen Materials durch Mikroglia und ermöglicht somit Einblicke in die funktionelle Aktivität von Mikroglia. Unser Protokoll wird andere Forschungsgruppen dazu inspirieren, funktionellere Assays in ihre Forschung einzubeziehen, wie z. B. verschlungene Motosynaptosomen, und dies wird zu einem besseren und umfassenderen Verständnis der Rolle von Mikroglia bei neuroimmunen Interaktionen führen.

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Abstract