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Summary

Aqui apresentamos dois protocolos para quantificar o engolfamento microglial de sinapses positivas para vGLUT1 e sinaptossomos brutos marcados com pHRodo Red usando citometria de fluxo.

Abstract

A microglia desempenha um papel fundamental no refinamento sináptico no cérebro. A análise do engolfamento microglial das sinapses é essencial para a compreensão desse processo; no entanto, os métodos atualmente disponíveis para identificar o engolfamento microglial das sinapses, como imuno-histoquímica (IHQ) e imagem, são trabalhosos e demorados. Para enfrentar esse desafio, apresentamos ensaios in vitro e in vivo* que permitem a quantificação rápida e de alto rendimento do engolfamento microglial de sinapses usando citometria de fluxo.

Na abordagem in vivo* , realizamos coloração intracelular de vGLUT1 após isolamento de células frescas de cérebros de camundongos adultos para quantificar o engolfamento de sinapses de vGLUT1+ pela microglia. No ensaio de engolfamento de sinaptossomas in vitro , usamos células recém-isoladas do cérebro de camundongos adultos para quantificar o engolfamento de sinaptossomos marcados com pHrodo Red por microglia. Esses protocolos juntos fornecem uma abordagem eficiente em termos de tempo para quantificar o engolfamento microglial de sinapses e representam alternativas promissoras para métodos baseados em análise de imagem trabalhosos. Ao agilizar a análise, esses ensaios podem contribuir para uma melhor compreensão do papel da microglia no refinamento sináptico em diferentes modelos de doenças.

Introduction

A microglia é a célula imune residente do sistema nervoso central (SNC)1. Eles verificam constantemente seu microambiente e fornecem vigilância 1,2. Além disso, eles freqüentemente interagem com as sinapses e medeiam um ajuste fino da atividade sináptica3. Assim, eles emergiram como um jogador-chave no processo de refinamento sináptico.

O papel da microglia no refinamento sináptico através do engolfamento de sinapses foi demonstrado por vários grupos de pesquisa 3,4,5,6,7. Interrupções nesse processo podem contribuir para a patologia de distúrbios do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos, como esquizofrenia e doença de Alzheimer8. O refinamento sináptico aberrante pela microglia já foi detectado em vários modelos murinos de distúrbios neurológicos 5,9,10. Portanto, a identificação de mecanismos distintos subjacentes ao engolfamento microglial das sinapses é fundamental para a compreensão da fisiopatologia dos distúrbios do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos8.

O direcionamento do engolfamento microglial das sinapses tem um grande potencial para intervir na progressão da doença e obter insights sobre os mecanismos subjacentes dos distúrbios do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos. Para facilitar essas investigações, são necessárias abordagens rápidas e de alto rendimento. As abordagens metodológicas atuais abrangem ensaios in vivo, ex vivo e in vitro que permitem a detecção de material sináptico dentro da microglia. Geralmente, a detecção do engolfamento microglial das sinapses depende muito da imuno-histoquímica (IHQ) e das abordagens baseadas em microscopia 5,6,11, que são trabalhosas e mostram limitações na análise de um grande número de microglia.

Dadas essas limitações técnicas, a exploração de metodologias alternativas é imperativa. Para superar isso, otimizamos uma abordagem baseada em citometria de fluxo, que permite uma análise eficiente, imparcial e de alto rendimento do engolfamento microglial das sinapses. Escolhemos o hipocampo como a principal região de interesse devido ao seu alto grau de remodelação sináptica e plasticidade12, mas o protocolo pode ser adaptado a várias regiões cerebrais. Embora a citometria de fluxo já tenha sido usada em estudos anteriores para detectar o engolfamento microglial de sinapses 13,14,15, fornecemos aqui uma metodologia passo a passo empregando um anticorpo vGLUT1 conjugado com fluoróforo atualmente disponível comercialmente. Além disso, fornecemos uma abordagem in vitro complementar para triagem de alto rendimento do engolfamento microglial de material sináptico usando sinaptossomos brutos.

Protocol

Uma visão geral do procedimento experimental é ilustrada graficamente na Figura 1A. Todos os experimentos envolvendo o manuseio de animais vivos utilizados foram realizados em estrita conformidade com a Lei Alemã de Proteção Animal e foram aprovados pelo Escritório Regional de Saúde e Serviços Sociais em Berlim (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlim, Alemanha). Os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas sob condições laboratoriais padrão com um ciclo claro/escuro de 12:12 h nas instalações do núcleo animal do Centro Max Delbrück de Medicina Molecular (MDC). Comida e água foram fornecidas ad libitum. Consulte a Tabela 1 para a composição de tampões e reagentes e a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os reagentes, instrumentos e materiais usados neste protocolo. Para o ensaio específico de vGLUT1, usamos o termo in vivo* em todo o manuscrito para reconhecer que a citometria de fluxo requer homogeneização de tecidos e isolamento celular, e a microglia exibe aproximadamente 95% de viabilidade após o procedimento de isolamento (Figura 1B e Figura Suplementar S1). Portanto, eles mantêm sua capacidade de engolir o material sináptico ex vivo, por um curto período, até a fixação. Assim, a quantificação da microglia vGLUT1+ compreende tanto o engolfamento ex vivo in vivo quanto o de curto prazo até a etapa de fixação.

1. Coloração intracelular de vGLUT1 para a detecção de engolfamento in vivo* de sinapses glutamatérgicas por microglia

NOTA: O seguinte procedimento de isolamento celular é adaptado de16. Todas as etapas do isolamento celular devem ser realizadas no gelo.

  1. Anestesiar os camundongos usando injeção intraperitoneal de pentobarbital. Perfunda os camundongos por via intracardíaca com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) gelada por ~ 2 min.
    NOTA: Um mouse é usado por amostra (n).
  2. Retire o cérebro do crânio e preserve-o em 1 mL de meio de células neurais.
    NOTA: O meio de células neurais, como o meio Hibernate-A, é usado para garantir a alta viabilidade das células após o processo de dissociação do tecido.
  3. Transfira o cérebro para uma placa de Petri cheia de 1 mL de meio de células neurais geladas e disseque o hipocampo conforme descrito anteriormente17.
  4. Transfira o hipocampo para um homogeneizador Dounce preenchido com 1 mL de meio de célula neural e dissocie o tecido usando o pilão solto com aproximadamente ~ 25 movimentos suaves.
  5. Coloque um filtro de 70 μm em um tubo de polipropileno de 5 mL e adicione 500 μL de meio de célula neural. Transfira o homogeneizado de tecido para o tubo de polipropileno de 5 mL através do filtro.
  6. Enxágue o homogeneizador Dounce 2x com 1 mL de meio de células neurais frias e centrifugue as amostras a 400 × g por 8 min.
  7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 μL de DPBS gelada por meio de pipetagem suave. Garanta uma suspensão homogênea e complete o volume final para 1,5 mL usando DPBS.
  8. Adicionar 500 μl de solução isotónica de Percoll à amostra, ressuspendê-la suavemente e cobri-la com mais 2 ml de DPBS frio.
  9. Centrifugue as amostras a 3.000 × g por 10 min com aceleração total e sem freio. Aspire a camada superior, bem como o disco de mielina na fase intermediária.
    NOTA: Todas as etapas de centrifugação a seguir são realizadas a 4 oC, se não for especificado de outra forma.
  10. Adicione 4 mL de DPBS frio e centrifugue as amostras a 400 × g por 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 μL de solução de coloração de viabilidade fixável e incubar as amostras durante 30 minutos a 4 °C.
  11. Adicione 1 mL de DPBS frio à amostra e centrifugue as amostras a 300 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante e adicione 100 μL de solução de coloração CD16 / CD32 (1/200 em tampão FACS). Vórtice por ~ 5 s e incubar por 10 min a 4 ° C.
    NOTA: A coloração CD16/CD32 é um pré-tratamento para minimizar a ligação não específica de anticorpos a células portadoras de FcR, como a microglia, antes de aplicações como citometria de fluxo.
  12. Adicione 1 mL de tampão FACS à amostra e centrifugue a 300 × g por 5 min. Aspire o sobrenadante e adicione 100 μL de coloração master mix-I (1/100 anti-CD11b / anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C / anti-Ly6G em 1x FACS Buffer). Incubar as amostras durante 20 min a 4°C no escuro.
  13. Adicione 1 mL de tampão FACS à amostra e centrifugue a 300 × g por 5 min.
  14. Ressuspenda o pellet em 250 μL de tampão de fixação. Incubar a 4 °C durante 25 min.
  15. Adicione 2 mL de tampão de permeabilização 1x (PERM) e centrifugue 300 × g por 5 min.
  16. Rejeitar o sobrenadante e adicionar 100 μL de vGLUT1 ou solução de coloração de controlo de isotipo. Vortex por ~ 5 s e incubar as amostras a 4 ° C por 50 min.
  17. Adicione 2 mL de 1x tampão PERM e centrifugue 300 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante e adicione 2 mL de tampão FACS às amostras.
  18. Centrifugar a 300 × g durante 5 min e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 250 μL de tampão FACS e passe as amostras por um filtro de filtro de 40 μm.
  19. Analise a intensidade de fluorescência de vGLUT1 de microglia única/viável/CD11b++/CD45+ usando citometria de fluxo. Use macrófagos do baço como controle negativo para cada experimento.
    1. Isole os esplenócitos comprimindo suavemente o tecido do baço picado através de um filtro de filtro de 70 μm duas vezes. Enxágue os filtros com 40 mL de DPBS e colete a suspensão em um tubo cônico de 50 mL.
    2. Centrifugue 350 × g por 10 min e ressuspenda o pellet resultante em uma solução de 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Incube por 10 min no gelo.
    3. Adicionar 10 ml de DPBS à amostra após a incubação e centrifugar a 350 × g durante 10 min.
    4. Prossiga com as etapas de coloração explicadas entre as etapas 1.11 e 1.17.
      NOTA: A estratégia de gating é fornecida na Figura Suplementar S2 para definir os macrófagos do baço como CD11b ++/ CD45 ++/ População de células viáveis.
    5. Estratégia de gating (Figura 1)
      1. Porta primária: Ajuste a área de dispersão direta (FSC-A) [eixo x] e a área de dispersão lateral (SSC-A) [eixo y] para incluir a população de microglia na área fechada e excluir os detritos celulares.
      2. Ajuste a Área de Dispersão Direta (FSC-A) [eixo x] e a Altura de Dispersão Direta (FSC-H) [eixo y] para excluir duplicatas. Os singlets aparecem como uma diagonal neste gráfico de pontos.
      3. Ajuste CD11b-PECy7 [eixo y] e CD45-APC [eixo x] e gate a população com um alto nível de superfície de CD11b e nível médio de CD45 como micróglia.
      4. Exclua células mortas na porta negativa FITC [eixo y]. OPCIONAL: Exclua também as células positivas para Ly6C e Ly6G-FITC na porta negativa para FITC para excluir macrófagos associados ao SNC da análise.
        NOTA: Em contraste com as células vivas, as células mortas com membranas comprometidas permitem que o corante de viabilidade fixável entre no citoplasma, o que aumenta a quantidade de marcação de proteínas18. Assim, as células mortas serão mais brilhantes do que as células vivas, que estão incluídas na porta definida.
      5. Ajuste CD45-APC [eixo x] e vGLUT1-PE [eixo y]; a população que se encontra acima do limiar de entrada, em que não foram detectados acontecimentos positivos na amostra de baço (controlo biológico interno negativo, figura 1E), é considerada como a fracção positiva para vGLUT1 na amostra.

2. Detecção de engolfamento in vitro de sinaptossomos brutos por microglia

  1. Preparação de sinaptossomas brutos e marcação com pHrodo Red
    NOTA: Todas as etapas a seguir devem ocorrer no gelo.
    1. Siga as etapas 1.1 a 1.2.
    2. Transfira o cérebro para uma placa de Petri cheia de 1 mL de meio de células neurais geladas e disseque cuidadosamente o hipocampo. Mantenha sempre a placa de Petri no gelo. Use hipocampos para isolamento da microglia na próxima etapa.
    3. Transfira o resto do cérebro (excluindo o cerebelo e o bulbo olfatório) para um homogeneizador Dounce cheio de 1 mL de reagente de extração de proteína sináptica e dissocie suavemente o tecido usando o pilão solto com aproximadamente ~ 30 golpes. Suplementar um comprimido de inibidor de protease por 10 ml do reagente de extracção e isolar os sinaptossomas de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Os reagentes de extração de proteínas sinápticas, como o SynPER19, são usados para preparar sinaptossomos que contêm proteínas pré e pós-sinápticas biologicamente ativas.
    4. Dissolver o sedimento bruto de sinaptossoma em 500 μL de solução de 0,1 M Na2CO3 . Corar a amostra de sinaptossomo com 10 μL de 0,2 mM de pHrodo Red. Incubar as amostras brutas de sinaptossomas à temperatura ambiente (24-25 °C) durante 1,5 h com agitação suave.
    5. Adicionar 1 ml de DPBS frio à amostra, centrifugar durante 1 min a velocidade máxima (20.815 × g) e aspirar o sobrenadante.
    6. Repita a etapa 2.1.5 por 7x no total para remover o pHrodo Red excessivo não ligado das amostras.
    7. Após a última centrifugação, realizar um ensaio padrão de BCA para quantificar as concentrações de proteína da amostra.
    8. Opcional: congelar amostras de sinaptossomo em DPBS com 5% de DMSO usando nitrogênio líquido e preservá-las por 3 semanas a -80 °C. Cubra os tubos com papel alumínio para manter a exposição mínima à luz.
  2. In vitro Ensaio bruto de engolfamento de sinaptossomas usando microglia adulta recém-isolada
    1. Prepare o aCSF e equilibre-o com 95% O2:5%CO2 por 30 min.
      NOTA: Para as etapas 2.2.2-2.2.4, siga as instruções do fabricante para a preparação da solução de digestão à base de papaína.
    2. Adicione 4 ml de aCSF ao frasco 2 do kit de papaína. Coloque o frasco para injetáveis em banho-maria a 37 °C durante ~10 min até que a solução de papaína pareça límpida.
    3. Adicione 400 μL de aCSF ao frasco 3 no kit de papaína. Misture delicadamente por ~ 10 vezes por pipetagem lenta.
    4. Adicionar 200 μL do frasco 3 ao frasco 2 (reconstruído no passo 2.2.3). Guarde o resto do frasco 3.
    5. Pegue o hipocampo dissecado na etapa 2.1.2 e pique o hipocampo dissecado usando um bisturi.
    6. Transferir o hipocampo picado para um tubo dissociador tecidual cheio de 2 ml de solução enzimática preparada no passo 2.2.5. Coloque o tubo no dissociador de tecido e execute o programa: 37C_ABDK_01 (leva ~ 30 min).
    7. Coloque as amostras em banho-maria a 37 °C por ~20 min e triture a mistura a cada 5 min usando uma pipeta de 1 mL sem fazer bolhas.
      NOTA: Este processo deve ser continuado até que o tecido esteja totalmente dissociado e pareça completamente homogêneo para garantir uma dissociação eficiente. Todas as etapas de centrifugação seguintes são realizadas a 4 oC, se não for especificado de outra forma.
    8. Remova cuidadosamente a suspensão de células turvas para um novo tubo de 15 mL e centrifugue a 300 × g por 5 min.
    9. Durante este período de 5 min, prepare a seguinte mistura de lavagem (5 mL) por amostra; adicione 500 μL de solução reconstituída de inibidor de albumina-ovomucóide fornecida no kit de papaína a 4,5 mL de aCSF. Adicione a solução restante no frasco 3 da etapa 2.2.5 à mistura de lavagem.
    10. Rejeitar o sobrenadante do passo 2.2.8 e ressuspender imediatamente o sedimento celular na solução de mistura de lavagem.
    11. Passe a amostra através de um filtro de 70 μm para um novo tubo de microcentrífuga de 5 mL. Centrifugar as amostras a 300 × g durante 5 min.
    12. Prossiga com a etapa de centrifugação do gradiente de Percoll explicada anteriormente nas etapas 1.7-1.9.
    13. Ressuspenda as células cuidadosamente no tampão de coloração MACS pipetando lentamente para cima e para baixo. Incubar as amostras durante 15 minutos a 4 °C.
    14. Adicione 1 mL de tampão MACS a cada amostra e centrifugue a 300 × g por 8 min.
    15. Ressuspenda as células em 500 μL de tampão MACS.
    16. Coloque as colunas de seleção positiva no separador magnético. Equilibre as colunas enxaguando-as com 3 mL de tampão MACS.
    17. Misture suavemente e aplique 500 μL da suspensão celular na coluna. Lave as colunas 3x com 3 mL de tampão MACS.
    18. Remova as colunas do separador magnético e coloque-as em tubos cônicos de 15 mL. Adicione 5 mL de tampão MACS na coluna e lave imediatamente as células usando um plumper. Centrifugar as amostras a 300 × g durante 10 min.
    19. Durante este período, prepare 20 mL de FBS a 40% em DPBS. Pré-aqueça 1 mL de DMEM por amostra até 37 ° C em banho-maria.
    20. Dissolva o grânulo celular final em 1 mL de DMEM pré-aquecido. Semeie cerca de ~ 150.000-200.000 células em 500 μL de DMEM pré-aquecido por poço em uma placa de 24 poços. Como controle, semeie um número semelhante de células em 1-2 poços extras. Verifique a confluência das células em todos os poços usando um microscópio óptico.
      NOTA: Se a região alvo do cérebro for hipocampo ou regiões cerebrais comparativamente pequenas, 5 camundongos podem ser agrupados por amostra (n) para isolar ~ 150.000 micróglia. Para todo o cérebro, 1 camundongo por n será suficiente para obter números semelhantes de células usando ambos os protocolos de isolamento. Alternativamente, ~ 40.000 células podem ser plaqueadas em placas de 96 poços em volume final de 100 μL para iniciar o ensaio de engolfamento. Isso reduz o número de células analisadas, mas também reduz o número de camundongos usados por n. A privação de proteínas devido à falta de FCS no DMEM desencadeará a fagocitose.
    21. Incubar a placa durante 1-2 h na incubadora (37 °C e 5% de CO2).
      NOTA: Esta etapa visa que as células se recuperem dos efeitos propensos ao estresse do procedimento de isolamento antes do início do ensaio de engolfamento funcional.
    22. Retire 250 μL de meio de cada poço muito lentamente, adicione 250 μL de DMEM fresco pré-aquecido a cada poço e adicione 3 μg de sinaptossomos marcados com pHRodo Red no topo. Verifique a confluência celular em todos os poços usando um microscópio óptico.
      1. Para os poços de controle negativo, adicione a mesma quantidade de sinaptossomos não marcados ao poço extra semeado com células.
      2. Para poços de teste, certifique-se de que o poço 1 contenha apenas células; o poço 2 contém células+ sinaptossomos não marcados; o poço-3 contém células+ 3 μg de pHrodo Red; o poço 4 contém DMEM + 3 μg de pHrodo Red.
    23. Incubar as células com sinaptossomas durante 2 h na incubadora (37 °C e 5% de CO2).
    24. Retire o meio e lave os poços com DPBS frio. Adicione 200 μL de solução de tripsina / EDTA por poço para separar as células por 35 s.
    25. Adicione 1 mL de 40% de FBS em DPBS por poço e transfira as células para um tubo de polipropileno de 5 mL através do filtro. Mantenha a placa e o tubo no gelo durante este processo para facilitar o desprendimento das células.
    26. Lave cada poço 2x usando 500 μL de DPBS gelado. Centrifugar as amostras recolhidas a 500 × g durante 5 min.
    27. Ressuspenda as células na solução de coloração contendo 1/200 CD16 / CD32 em 100 μL de tampão FACS e incube por 10 min em gelo.
    28. Após a incubação, adicione CD11b e CD45 à solução de coloração com uma concentração final de 1/100 de cada um. Incubar as amostras durante 20 min a 4 °C na obscuridade.
    29. Lave as amostras com 1 mL de tampão FACS e centrifugue-as a 300 × g por 10 min.
    30. Ressuspenda o pellet em 250 μL de tampão FACS e registre pelo menos 100.000 eventos totais usando citometria de fluxo. Analise a intensidade de fluorescência do pHrodo Red da microglia CD11b++/CD45+ .
    31. Estratégia de bloqueio (Figura 2C)
      1. Ajuste a porta primária: Área de dispersão direta (FSC-A) [eixo x] e Área de dispersão lateral (SSC-A) [eixo x] para incluir a população de micróglias na área fechada e excluir os detritos celulares.
      2. Ajuste a Área de Dispersão Direta (FSC-A) [eixo x] e a Altura de Dispersão Direta (FSC-H) [eixo y] para excluir duplicatas. Os singlets aparecem como uma diagonal neste gráfico de pontos.
      3. Ajuste CD11b-PECy7 [eixo y] e CD45-APC [eixo x] e gate a população com CD11b de alto nível de superfície e nível médio de CD45 como micróglia.
      4. Calcule a intensidade média de fluorescência do pHrodo-PE desta população. Use as mesmas células incubadas com sinaptossomos não marcados como controle negativo.

Representative Results

Neste projeto, otimizamos e apresentamos dois protocolos para medir o engolfamento in vivo* e in vitro de sinapses por microglia. No primeiro protocolo, nos concentramos no engolfamento in vivo* de sinapses positivas para vGLUT1. Como ponto de partida, utilizamos um protocolo publicado anteriormente14. No entanto, os anticorpos FACS usados neste protocolo foram descontinuados e adicionamos muitas etapas de otimização, bem como um novo método para isolamento da microglia16. É por isso que vale a pena compartilhar com a comunidade científica o protocolo aqui apresentado como uma atualização abrangente dos protocolos já publicados.

Para quantificar o engolfamento microglial das sinapses, usamos camundongos machos C57BL / 6N com idades entre 11 e 14 semanas. O hipocampo foi selecionado como a principal região de interesse devido ao seu alto grau de remodelamento sináptico e plasticidade12. Analisamos a microglia %vGLUT1-positiva, bem como a intensidade de fluorescência (MFI) vGLUT1-PE específica da microglia no hipocampo de camundongos C57BL / 6N. Macrófagos do baço derivados dos mesmos animais foram usados como controle biológico negativo por experimento. Testamos o anticorpo vGLUT1 demonstrando um sinal de fluorescência vGLUT1-PE mais alto da microglia hipocampal em comparação com o controle do isotipo e macrófagos do baço (Figura 1B-E)

Além disso, comparamos o engolfamento microglial de sinapses no cerebelo e no bulbo olfatório (como outra referência para alta plasticidade sináptica)20. Encontramos um sinal de fluorescência vGLUT1 mais alto na microglia do bulbo olfatório e um sinal mais baixo no cerebelo em comparação com o hipocampo (Figura 1F). A menor intensidade de sinal foi detectada nos macrófagos do baço, servindo como controle interno negativo (Figura 1E). Além disso, usamos camundongos Vglut-IRES-Cre / ChR2-YFP para testar a imunorreatividade de nosso anticorpo vGLUT1. YFP é expresso pelos neurônios glutamatérgicos desses camundongos, indicando que a população positiva para YFP também deve incluir uma fração positiva para vGLUT1. Usando este protocolo de coloração, detectamos 98,7% da população positiva para YFP como vGLUT1-positiva, validando a eficiência de nosso anticorpo (Figura Suplementar S3).

No geral, esses resultados validam a eficiência do anticorpo vGLUT1 e o protocolo de coloração apresentado. Demonstramos que este protocolo e o anticorpo podem ser usados com confiança para quantificar in vivo* o engolfamento de sinapses de maneira rápida e de alto rendimento em comparação com outras abordagens experimentais.

Passando para o método in vitro , isolamos micróglias adultas e as incubamos com sinaptossomos marcados com pHrodo Red recém-isolados dos mesmos animais para quantificar seu engolfamento in vitro (Figura 2A). Marcamos os sinaptossomos com pHrodo Red, o que aumenta naturalmente o sinal de fluorescência em pH circundante ácido21. Isolamos recentemente os sinaptossomos e os expomos a diferentes valores de pH (pH = 4 e pH = 11). Depois de confirmar o aumento do sinal de fluorescência em pH baixo como um experimento de prova de princípio (Figura 2B), incubamos esses sinaptossomos com microglia recém-isolada por 1,5-2 h. Como controle, incubamos a micróglia com sinaptossomos não marcados. Em seguida, analisamos o sinal de fluorescência pHrodo Red-PE da microglia CD11b ++ / CD45 + e observamos uma fluorescência PE positiva, comparável à obtida dos sinaptossomos em pH = 4 (Figura 2C). Assim, este método fornece uma análise rápida e de alto rendimento do engolfamento in vitro de sinaptossomos e pode ser estendido para placas amilóides ou o engolfamento de outros alvos potenciais seguindo as etapas de otimização necessárias. De fato, Rangaraju et al. quantificou o engolfamento de beta amilóide pela microglia usando uma abordagem semelhante baseada em citometria de fluxo22. Em conclusão, esses dois métodos fornecem quantificação robusta, eficiente e de alto rendimento do engolfamento microglial de sinapses tanto in vivo* quanto in vitro.

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Figura 1: Análise do engolfamento microglial das sinapses vGLUT1+ in vivo*. (A) Ilustração gráfica do fluxo de trabalho experimental que descreve as etapas da coloração intracelular de vGLUT1. (B) Estratégia de bloqueio para definir uma população de células viáveis única / CD11b ++ / CD45 + / do hipocampo. Essa população foi usada para analisar vGLUT1-MFI, bem como para quantificar a porcentagem de microglia vGLUT1+ no hipocampo. A porta mostrada com o retângulo vermelho indica a fração de célula vGLUT1+ na amostra total. (C) O histograma indica a intensidade de fluorescência de vGLUT1-PE. (D) A porta mostrada com o retângulo vermelho indica que não há fração celular positiva mostrando imunorreatividade ao Isotipo-PE. O histograma indica a intensidade de fluorescência do Isotipo-PE. (E) A porta mostrada com o retângulo vermelho indica que não há fração celular positiva mostrando imunorreatividade vGLUT1-PE nos macrófagos do baço. O histograma indica a intensidade de fluorescência do vGLUT1-PE. A porta indicada no histograma começa no nível em que o vGLUT1-MFI do baço termina (~ 104) e é usado para analisar a fração positiva de vGLUT1 nas amostras cerebrais. (F) O histograma sobreposto mostra a comparação da intensidade de fluorescência PE de macrófagos do baço (cinza) e micróglia do hipocampo (vermelho), cerebelo (roxo) e bulbo olfatório (azul claro). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Análise do engolfamento microglial das sinapses dos sinaptossomos in vitro. (A) Ilustração gráfica do fluxo de trabalho experimental que descreve as etapas do ensaio de engolfamento dos sinaptossomos in vitro. (B) Sinaptossomos incubados em dois valores de pH diferentes mostram um sinal de fluorescência de pHrodo Red-PE baixo em pH = 11 e uma fluorescência de pHrodoRed-PE alta em pH = 4. (C) A população de células únicas/CD11b++/CD45+ foi usada para analisar a intensidade de fluorescência do pHrodo Red-PE. Microglia incubada com sinaptossomos não corados foram usados como controle negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de tampões e reagentes usados neste protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura suplementar S1: Imagem representativa da micróglia adulta recém-isolada. Imagem adquirida usando um microscópio óptico com objetiva de 20x seguindo o protocolo de dissociação tecidual à base de papaína e isolamento baseado em MACS de microglia CD11b+. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S2: Gráficos FACS representativos demonstrando a estratégia de gating para definir macrófagos do baço. O baço foi usado como controle negativo nos experimentos por execução experimental enquanto testava o engolfamento microglial de sinapses no hipocampo. Os gráficos FACS fornecidos acima definem os macrófagos do baço como população CD11b ++ / CD45 ++ / viável. Essa população foi usada para definir um limite para quantificar a microglia vGLUT1+ nas amostras cerebrais que residem acima desse limiar Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S3: Gráficos FACS representativos demonstrando a estratégia de gating para testar a eficiência do anticorpo vGLUT1. (A) Ilustração gráfica do fluxo de trabalho experimental que descreve as etapas da coloração vGLUT1. Neurônios glutamatérgicos YFP+ foram usados para testar a imunorreatividade do anticorpo vGLUT1. (B) Estratégia de bloqueio para definir a população YFP+ do hipocampo de camundongos Vglut-IRES-Cre//ChR2-YFP que foram usados como controle positivo para testar a eficiência do anticorpo vGLUT1 FACS. A fração YFP+ foi fechada para especificar sinapses glutamatérgicas. Nessa população, a imunorreatividade do anticorpo vGLUT1 foi analisada para testar a imunorreatividade do anticorpo. Em comparação com o controle do isotipo (C); 97,9% da fração celular positiva para YFP é detectada como (D) vGLUT1-positiva. (E) O histograma sobreposto indica a comparação da fluorescência PE entre o isotipo e o anticorpo vGLUT1. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O refinamento sináptico por meio da interação microglia-sinapse é uma área de estudo intrigante no campo da neuroimunologia, oferecendo insights promissores sobre o papel da microglia em distúrbios neurodegenerativos e do neurodesenvolvimento. Em 2011; Paolicelli et al. forneceram evidências da presença de material sináptico dentro da microglia, lançando luz sobre seu envolvimento no processo de engolfamento sináptico4. Outro estudo intrigante empregou imagens de lapso de tempo e um modelo de cultura de fatia cerebral organotípica ex vivo e relatou que a microglia se envolve em um processo fagocítico conhecido como trogocitose, onde engolfa estruturas pré-sinápticas em vez de toda a estrutura sináptica23. Uma publicação muito recente usando um novo modelo de camundongo transgênico que permite a medição da fagocitose em tecido intacto mostrou poda por Bergmann-glia in vivo após aprendizado motor24. Assim, há evidências suficientes indicando o envolvimento de células gliais no engolfamento sináptico, incluindo a microglia. No entanto, até que ponto essa função microglial afeta o processo dinâmico e seletivo de poda sináptica requer mais evidências.

No entanto, a quantificação do engolfamento microglial das sinapses serve como um indicador valioso e fornece uma visão parcial da dinâmica complexa das interações microglia-sinapse, especialmente o refinamento sináptico. Uma revisão abrangente resumiu os protocolos atuais usados para investigar o engolfamento das sinapses da microglia25. Gostaríamos de enfatizar que nossos protocolos são otimizados com base nos protocolos existentes que já estão em uso. Os métodos apresentados neste estudo fornecem quantificação rápida e de alto rendimento: engolfamento microglial de sinapses em várias regiões cerebrais dissecadas. Dependendo da região do cérebro, uma análise de pelo menos 10.000 células microgliais em um máximo de dois dias é possível para ambas as metodologias, tornando-as valiosas para testar vários modelos de camundongos em paralelo.

Reconhecemos que a quantificação da microglia vGLUT1+ compreende tanto o engolfamento ex vivo in vivo quanto o de curto prazo até a etapa de fixação. Portanto, sugerimos que nosso ensaio apresente uma maneira rápida e confiável de quantificar o material sináptico dentro da micróglia como uma etapa inicial antes da validação in vivo usando abordagens como IHC.

Outra desvantagem da análise por citometria de fluxo é a disponibilidade limitada de anticorpos para marcadores sinápticos, particularmente para sinapses inibitórias. É um desafio encontrar anticorpos diretamente conjugados disponíveis comercialmente que mostrem um sinal brilhante para esses marcadores. Dado o extenso tempo de otimização necessário para testar diferentes anticorpos direcionados a marcadores sinápticos, é importante compartilhar os procedimentos bem otimizados com a comunidade científica para coloração intracelular com diferentes anticorpos, como fazemos aqui com este estudo.

Em relação à análise dos dados neste estudo, usamos controles de isotipo como controles técnicos negativos para contabilizar ligações não específicas do anticorpo vGLUT1, uma vez que fornecem uma estimativa para a ligação inespecífica de um anticorpo em uma amostra enquanto otimizam os ensaios baseados em citometria de fluxo26. No entanto, os controles de isotipo foram otimizados principalmente para detectar o sinal de fundo inespecífico dos procedimentos de coloração de superfície e não são ideais para controles de coloração intracelular27,28. Portanto, eles não devem ser usados para distinguir entre as populações negativas e positivas ao realizar a coloração intracelular, que envolve etapas de fixação e permeabilização que podem afetar a detecção de antígenos, autofluorescência e brilho do fluoróforo29. Tais procedimentos de coloração intracelular requerem o uso de controles biológicos internos apropriados para definir a população de células positivas coradas para um marcador intracelular29. Assim, considerando que utilizamos um protocolo de coloração intracelular, empregamos um controle biológico negativo interno (macrófagos do baço) e definimos o limite entre as populações positivas e negativas de acordo com os macrófagos do baço isolados dos mesmos camundongos. Distinguimos a população positiva acima do portão, na qual não há eventos positivos para vGLUT1 dos macrófagos do baço que servem como controle biológico negativo (Figura 1).

Ambos os métodos apresentados neste estudo oferecem grande potencial para a análise inicial do engolfamento microglial das sinapses de maneira rápida e de alto rendimento, analisando mais de 10.000 células de pequenas regiões cerebrais e isso não é possível com técnicas de microscopia padrão. Portanto, esses métodos oferecem uma vantagem significativa sobre os métodos de trabalho e tempo intensivo e, além disso, fornecem uma análise mais abrangente do engolfamento sináptico, permitindo uma análise de um número maior de micróglias. Além disso, o método in vitro apresentado neste estudo é particularmente útil para testar o impacto de diferentes tratamentos no engolfamento microglial das sinapses. Ele permite a quantificação direta do efeito do tratamento na microglia sem os fatores de confusão associados a outros tipos de células. Além disso, serve como uma abordagem indireta para provar um efeito potencial do microambiente ou de outros tipos de células no processo de engolfamento sináptico. Portanto, concluímos que esses métodos, especialmente quando usados em paralelo, oferecem alternativas intuitivas e vantajosas para a análise do engolfamento microglial de materiais sinápticos.

No entanto, a análise de micróglias recém-isoladas por ensaios fagocíticos baseados em FACS ex vivo pode apresentar algumas desvantagens. Primeiro, é fundamental empregar protocolos bem otimizados que gerem microglia recém-isolada do cérebro adulto, evitando a ativação ex vivo e a resposta ao estresse da microglia. Dissing-Olesen et al. incorporaram o uso de inibidores transcricionais e translacionais para superar esse problema, empregando um procedimento de dissociação tecidual a 37 oC30. Mattei et al., por outro lado, apresentaram um protocolo de dissociação tecidual mecânica e fria para evitar a indução da expressão ex vivo de genes associados ao estresse16 e adaptamos esse protocolo na primeira seção para evitar a ativação ex vivo da resposta da microglia associada ao estresse antes da coloração intracelular de vGLUT1. Empregamos um protocolo de dissociação enzimática do tecido na segunda seção antes do ensaio de engolfamento do sinaptossomo in vitro , considerando o maior rendimento da microglia após a dissociação do tecido à base de papaína (dados não mostrados). A microglia inevitavelmente permanece a 37 oC em condições de cultura quando incubada com sinaptossomos, e a incubação a 37 oC pode de fato induzir alterações na microglia como desvantagens comuns de todos os ensaios in vitro e procedimentos de cultura de células. Portanto, sugerimos o uso de ambos os protocolos apresentados em paralelo para chegar a uma conclusão mais ampla em termos de engolfamento microglial de sinapses.

Além disso, é importante definir cuidadosamente a estratégia de gating para selecionar a microglia CD11b++/CD45+ , levando em consideração a presença de outras células imunes no parênquima cerebral que também expressam esses marcadores31. Mais importante, ao escolher marcadores para atingir especificamente a micróglia (por exemplo, TMEM119, P2RY12), é importante considerar que eles podem sofrer alterações em seus níveis de expressão durante condições patológicas e inflamatórias32, e tais alterações devem ser consideradas antes de estabelecer o painel FACS para quantificar o engolfamento microglial das sinapses. Finalmente, é essencial enfatizar que nenhum dos métodos discutidos anteriormente, incluindo as abordagens in vivo baseadas em IHC e microscopia, pode capturar sozinho a poda ativa e seletiva de sinapses por microglia. Esses métodos não são capazes de discriminar a poda ativa pela micróglia da eliminação passiva de detritos sinápticos dentro do parênquima cerebral. Portanto, ao avaliar e discutir os dados, é imperativo distinguir claramente entre esses conceitos distintos.

Acknowledgements

Agradecemos a Regina Piske pela assistência técnica com o isolamento da microglia e ao Dr. Caio Andreta Figueiredo pelo auxílio na aquisição das imagens de microscopia na Figura Suplementar S1. Agradecemos às instalações FACS do MDC por seu apoio técnico. Este manuscrito apresenta parcialmente os números representativos submetidos ao Brain, Behavior and Immunity Journal em 2024. A Figura 1A, a Figura 2A e a Figura Suplementar S3A foram criadas usando BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Dounce HomogenizerActive MotifCat# 40401
5 mL TubesEppendorfCat# 0030119452
Anti-CD11bThermoFisher ScientificCat# 25-0112-82
Anti-CD45BDCat# 559864
Anti-Ly6CBDCat# 553104
Anti-Ly6GBDCat# 551460
BCA Protein Assay KitPierceCat# 23227
C-TubesMiltenyi BiotechCat# 130-096-334
CD11b MicroBeadsMiltenyi BiotechCat# 130-093-634
CD16/CD32 AntibodyThermo Fisher ScientificCat#14-0161-82
Cytofix/Cytoperm KitBDCat# 554714
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoCat# 41966029
Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline  (DPBS)GibcoCat# 14190144
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes Thermo Fisher ScientificCat# 08-771-23
fixable viability dyeThermo Fisher ScientificCat# L34969
Hibernate A mediumThermoFisherCat# A1247501
LS-columnsMiltenyi BiotechCat# 130-042-401
Papain Dissociation SystemWorthingtonCat# LK003150
PercollTh.GeyerCat# 17-0891-02
Petri dishesThermo Fisher ScientificCat# 11339283
pHrodoRedThermo Fisher ScientificCat# P36600
Protease inhibitorRocheCat# 5892970001
Red Blood Cell Lysis BufferSigma Cat# 11814389001
Steritop E-GP Sterile Filtration SystemMerckCat# SEGPT0038
SynPer SolutionThermoFisherCat# 87793
vGLUT1 AntibodyMiltenyi BiotechCat# 130-120-764

References

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