חשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי של מדולובלסטומה

Summary

תכולת הידרופרוקסיד שומנים מייצגת את האינדיקטור הנפוץ ביותר למוות של תאים פרופטוטיים. מאמר זה מדגים את ניתוח ציטומטריית הזרימה שלב אחר שלב של תכולת הידרופראוקסיד שומנים בתאים עם השראת פרופטוזיס.

Abstract

האינטראקציה של ברזל וחמצן היא חלק בלתי נפרד מהתפתחות החיים על פני כדור הארץ. עם זאת, כימיה ייחודית זו ממשיכה לרתק ולתהות, ומובילה למיזמים ביולוגיים חדשים. בשנת 2012, קבוצה מאוניברסיטת קולומביה הכירה באינטראקציה זו כאירוע מרכזי המוביל לסוג חדש של מוות תאי מווסת בשם "פרופטוזיס". המאפיין העיקרי של פרופטוזיס הוא הצטברות של הידרופרוקסידים ליפידים עקב (1) הגנה נוגדת חמצון לא מתפקדת ו / או (2) עקה חמצונית מוחצת, אשר לרוב עולה בקנה אחד עם תוכן מוגבר של ברזל חופשי בתא. זה נמנע בדרך כלל על ידי הציר האנטי-פרופטוטי הקנוני הכולל את טרנספורטר הציסטין xCT, גלוטתיון (GSH) ו- GSH peroxidase 4 (GPx4). מכיוון שפרופטוזיס אינו סוג מתוכנת של מוות תאי, הוא אינו כרוך במסלולי איתות האופייניים לאפופטוזיס. הדרך הנפוצה ביותר להוכיח סוג זה של מוות תאי היא באמצעות נוגדי חמצון ליפופיליים (ויטמין E, ferrostatin-1, וכו ') כדי למנוע את זה. מולקולות אלה יכולות להתקרב ולסלק נזקי חמצון בקרום הפלזמה. היבט חשוב נוסף בחשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי הוא זיהוי הצטברות קודמת של הידרופרוקסידים ליפידים, שעבורם משתמשים בצבע הספציפי BODIPY C11. כתב היד הנוכחי יראה כיצד ניתן לגרום לפרופטוזיס בתאי מדולובלסטומה מסוג בר באמצעות השראות שונות: ארסטין, RSL3 ותורם ברזל. באופן דומה, ייעשה שימוש בתאי xCT-KO שגדלים בנוכחות NAC, ועוברים פרופטוזיס לאחר הסרת NAC. הפנוטיפ ה"מבעבע" האופייני נראה תחת מיקרוסקופ האור תוך 12-16 שעות מרגע הפעלת הפרופטוזיס. יתר על כן, ייעשה שימוש בצביעת BODIPY C11 ואחריה ניתוח FACS כדי להראות הצטברות של הידרופרוקסידים ליפידים ומוות תאים כתוצאה מכך באמצעות שיטת צביעת PI. כדי להוכיח את האופי הפרופטוטי של מוות תאי, ferrostatin-1 ישמש כסוכן ספציפי המונע פרופטוזיס.

Introduction

פרופטוזיס (Ferroptosis) הוא סוג חדש של חמצן תגובתי (ROS) התלוי במוות תאי¹. מלבד ROS, ברזל ממלא תפקיד מכריע בסוג זה של מוות תאי, ומכאן השם². השלב האחרון והביצועי של פרופטוזיס הוא הצטברות ברזל של נזק חמצוני של שומנים בקרום הפלזמה שבסופו של דבר מוביל לפגיעה בשלמות הממברנה וחדירות סלקטיבית, ולבסוף, מוות תאי על ידי בעבוע. אירוע הידרופרוקסידציה של שומנים הוא תופעה טבעית; עם זאת, התפשטותו ברחבי קרום התא נמנעת על ידי ההגנה נוגדת החמצון של התא. השחקן העיקרי בהקשר זה הוא חלבון Se גלוטתיון פרוקסידאז 4 (GPx4), שיכול להתקרב לממברנה ולהמיר הידרופרוקסידים ליפידים לנגזרות האלכוהול הפחות רעילות שלהם³. כוח ההפחתה ש....

Protocol

המחקר הנוכחי נערך באמצעות קווי תאים מסוג DAOY wild-type (WT) medulloblastoma, אשר גודלו בתרבית ב 37 ° C עם 5% CO₂ בתווך DMEM בתוספת 8% FBS. קו התאים שנמחק xCT נשמר באותם תנאים, עם ניסויים שבוצעו במדיה בתוספת 1 mM N-אצטיל-ציסטאין (NAC). התאים נבדקו באופן קבוע למיקופלסמה באמצעות ערכה מסחרית לזיהוי מיקופלסמה (ראו טב.......

Discussion

סימן ההיכר העיקרי של מוות תאי פרופטוטי הוא הצטברות בלתי מבוקרת של הידרופרוקסידים ליפידים בקרום הפלזמה. נזק חמצוני זה עלול להתרחש באופן אנזימטי או לא אנזימטי, אך בכל מקרה, התגובה תלויה בברזל/מזורזת, מה שמסביר את שמו של סוג זה של מוות תאי. הידרופרוקסידציה של שומנים מוערכת לעתים קרובות בעקיפי.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100