Revelando o fenótipo ferropótico do meduloblastoma

Summary

O teor de hidroperóxido lipídico representa o indicador mais comumente usado de morte celular ferroptótica. Este artigo demonstra a análise passo a passo da citometria de fluxo do conteúdo de hidroperóxido lipídico nas células após a indução da ferroptose.

Abstract

A interação de ferro e oxigênio é parte integrante do desenvolvimento da vida na Terra. No entanto, essa química única continua a fascinar e confundir, levando a novos empreendimentos biológicos. Em 2012, um grupo da Universidade de Columbia reconheceu essa interação como um evento central que leva a um novo tipo de morte celular regulada chamada "ferroptose". A principal característica da ferroptose é o acúmulo de hidroperóxidos lipídicos devido a (1) defesa antioxidante disfuncional e / ou (2) estresse oxidativo avassalador, que mais frequentemente coincide com o aumento do conteúdo de ferro lábil livre na célula. Isso normalmente é evitado pelo eixo antiferroptótico canônico que compreende o transportador de cistina xCT, glutationa (GSH) e GSH peroxidase 4 (GPx4). Como a ferroptose não é um tipo programado de morte celular, ela não envolve vias de sinalização características da apoptose. A maneira mais comum de provar esse tipo de morte celular é usando antioxidantes lipofílicos (vitamina E, ferrostatina-1, etc.) para evitá-la. Essas moléculas podem se aproximar e desintoxicar o dano oxidativo na membrana plasmática. Outro aspecto importante na revelação do fenótipo ferroptótico é a detecção do acúmulo anterior de hidroperóxidos lipídicos, para os quais o corante específico BODIPY C11 é usado. O presente manuscrito mostrará como a ferroptose pode ser induzida em células de meduloblastoma do tipo selvagem usando diferentes indutores: erastina, RSL3 e doador de ferro. Da mesma forma, as células xCT-KO que crescem na presença de NAC e que sofrem ferroptose quando o NAC é removido serão usadas. O fenótipo característico de "borbulhamento" é visível ao microscópio óptico dentro de 12-16 h a partir do momento do desencadeamento da ferroptose. Além disso, será utilizada a coloração BODIPY C11 seguida de análise FACS para mostrar o acúmulo de hidroperóxidos lipídicos e consequente morte celular usando o método de coloração PI. Para provar a natureza ferroptótica da morte celular, a ferrostatina-1 será usada como um agente específico de prevenção da ferroptose.

Introduction

A ferroptose é um tipo de morte celular dependente de espécies reativas de oxigênio (ROS) recém-contextualizadas¹. Além das ROS, o ferro desempenha um papel crucial nesse tipo de morte celular, daí o nome². A etapa final e executiva da ferroptose é o acúmulo catalisado por ferro de dano oxidativo de lipídios na membrana plasmática que eventualmente leva ao comprometimento da integridade da membrana e permeabilidade seletiva e, finalmente, à morte celular por borbulhamento. O evento de hidroperoxidação lipídica é um fenômeno que ocorre naturalmente; no entanto, sua propagação por toda a membrana celular é impedida pela de....

Protocol

O presente estudo foi conduzido usando linhagens celulares de meduloblastoma do tipo selvagem (WT) DAOY, que foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO₂ em meio DMEM suplementado com 8% de FBS. A linhagem celular deletada por xCT foi mantida nas mesmas condições, com experimentos realizados em meio suplementado com N-acetilcisteína (NAC) 1 mM. As células foram regularmente rastreadas para micoplasma usando um Kit de Detecção de Micoplasma disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) .......

Discussion

A principal característica da morte celular ferroptótica é o acúmulo descontrolado de hidroperóxidos lipídicos na membrana plasmática. Esse dano oxidativo pode ocorrer de forma enzimática ou não enzimática, mas em ambos os casos, a reação é ferro-dependente/catalisada, o que explica o nome desse tipo de morte celular. A hidroperoxidação lipídica é frequentemente estimada indiretamente medindo os produtos de degradação da hidroperoxidação lipídica, como 4-hidroxi-2,3-transnonenal (4-HNE) ou malonalde.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100