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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

O teor de hidroperóxido lipídico representa o indicador mais comumente usado de morte celular ferroptótica. Este artigo demonstra a análise passo a passo da citometria de fluxo do conteúdo de hidroperóxido lipídico nas células após a indução da ferroptose.

Abstract

A interação de ferro e oxigênio é parte integrante do desenvolvimento da vida na Terra. No entanto, essa química única continua a fascinar e confundir, levando a novos empreendimentos biológicos. Em 2012, um grupo da Universidade de Columbia reconheceu essa interação como um evento central que leva a um novo tipo de morte celular regulada chamada "ferroptose". A principal característica da ferroptose é o acúmulo de hidroperóxidos lipídicos devido a (1) defesa antioxidante disfuncional e / ou (2) estresse oxidativo avassalador, que mais frequentemente coincide com o aumento do conteúdo de ferro lábil livre na célula. Isso normalmente é evitado pelo eixo antiferroptótico canônico que compreende o transportador de cistina xCT, glutationa (GSH) e GSH peroxidase 4 (GPx4). Como a ferroptose não é um tipo programado de morte celular, ela não envolve vias de sinalização características da apoptose. A maneira mais comum de provar esse tipo de morte celular é usando antioxidantes lipofílicos (vitamina E, ferrostatina-1, etc.) para evitá-la. Essas moléculas podem se aproximar e desintoxicar o dano oxidativo na membrana plasmática. Outro aspecto importante na revelação do fenótipo ferroptótico é a detecção do acúmulo anterior de hidroperóxidos lipídicos, para os quais o corante específico BODIPY C11 é usado. O presente manuscrito mostrará como a ferroptose pode ser induzida em células de meduloblastoma do tipo selvagem usando diferentes indutores: erastina, RSL3 e doador de ferro. Da mesma forma, as células xCT-KO que crescem na presença de NAC e que sofrem ferroptose quando o NAC é removido serão usadas. O fenótipo característico de "borbulhamento" é visível ao microscópio óptico dentro de 12-16 h a partir do momento do desencadeamento da ferroptose. Além disso, será utilizada a coloração BODIPY C11 seguida de análise FACS para mostrar o acúmulo de hidroperóxidos lipídicos e consequente morte celular usando o método de coloração PI. Para provar a natureza ferroptótica da morte celular, a ferrostatina-1 será usada como um agente específico de prevenção da ferroptose.

Introduction

A ferroptose é um tipo de morte celular dependente de espécies reativas de oxigênio (ROS) recém-contextualizadas1. Além das ROS, o ferro desempenha um papel crucial nesse tipo de morte celular, daí o nome2. A etapa final e executiva da ferroptose é o acúmulo catalisado por ferro de dano oxidativo de lipídios na membrana plasmática que eventualmente leva ao comprometimento da integridade da membrana e permeabilidade seletiva e, finalmente, à morte celular por borbulhamento. O evento de hidroperoxidação lipídica é um fenômeno que ocorre naturalmente; no entanto, sua propagação por toda a membrana celular é impedida pela de....

Protocol

O presente estudo foi conduzido usando linhagens celulares de meduloblastoma do tipo selvagem (WT) DAOY, que foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO2 em meio DMEM suplementado com 8% de FBS. A linhagem celular deletada por xCT foi mantida nas mesmas condições, com experimentos realizados em meio suplementado com N-acetilcisteína (NAC) 1 mM. As células foram regularmente rastreadas para micoplasma usando um Kit de Detecção de Micoplasma disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) .......

Representative Results

A linhagem celular de meduloblastoma DAOY foi cultivada em meio DMEM padrão suplementado com 8% de FBS até atingir aproximadamente 60% de confluência. No dia do experimento, as células foram colhidas e 1.00.000 células por poço foram semeadas em placas de 6 poços, de acordo com a Tabela 1. No dia seguinte, as células (em triplicata) foram tratadas com 1 μM de erastina, 0,3 μM de RSL3 ou 250 μM de FAC. As placas foram então colocadas na incubadora a 37 °C e 5% de CO2. Após 6 h, as.......

Discussion

A principal característica da morte celular ferroptótica é o acúmulo descontrolado de hidroperóxidos lipídicos na membrana plasmática. Esse dano oxidativo pode ocorrer de forma enzimática ou não enzimática, mas em ambos os casos, a reação é ferro-dependente/catalisada, o que explica o nome desse tipo de morte celular. A hidroperoxidação lipídica é frequentemente estimada indiretamente medindo os produtos de degradação da hidroperoxidação lipídica, como 4-hidroxi-2,3-transnonenal (4-HNE) ou malonalde.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo governo do Principado de Mônaco, bem como pelo 'Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer' (GEMLUC) e pela Fundação Flavien, que forneceu os meios para a compra da BD FACS Melody.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BODIPY 581/591 C11Thermo FisherD3861
Cell counterBeckmanCoulter Z1
DMEM medium Gibco10569010
ErastinSigma-AldrichE7781-5MG
Ferroamminium citrateAcros Organics211842500
Ferrostatin-1Sigma-AldrichSML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)Dominique Dutcher500105N1N
Flow CytometerBD BiosciencesFACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermo Fisher11599686
N-acetylcysteineSigma-AldrichA7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection KitInvivoGenrep-pt1
propidium iodideInvitrogenP3566
RSL3Sigma-AldrichSML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mLDominique DutcherX0930-100

References

  1. Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
  2. Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthet....

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