Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Содержание гидропероксида липидов является наиболее часто используемым индикатором гибели ферроптозных клеток. В данной статье представлен пошаговый анализ содержания гидропероксида липидов в клетках с помощью проточной цитометрии при индукции ферроптоза.

Abstract

Взаимодействие железа и кислорода является неотъемлемой частью развития жизни на Земле. Тем не менее, эта уникальная химия продолжает очаровывать и озадачивать, приводя к новым биологическим предприятиям. В 2012 году группа из Колумбийского университета признала это взаимодействие центральным событием, ведущим к новому типу регулируемой клеточной смерти, названному «ферроптозом». Основной особенностью ферроптоза является накопление гидропероксидов липидов вследствие (1) дисфункциональной антиоксидантной защиты и/или (2) подавляющего окислительного стресса, который чаще всего совпадает с повышенным содержанием свободного лабильного железа в клетке. Обычно это предотвращается канонической антиферроптозной осью, содержащей транспортер цистина xCT, глутатион (GSH) и пероксидазу GSH 4 (GPx4). Поскольку ферроптоз не является запрограммированным типом клеточной смерти, он не включает в себя сигнальные пути, характерные для апоптоза. Наиболее распространенным способом доказать этот тип клеточной смерти является использование липофильных антиоксидантов (витамин Е, ферростатин-1 и т.д.) для ее предотвращения. Эти молекулы могут приближаться к окислительному повреждению плазматической мембраны и выводить его из токсина. Другим важным аспектом в выявлении ферроптотического фенотипа является обнаружение предшествующего накопления гидропероксидов липидов, для чего используется специфический краситель BODIPY C11. В настоящей рукописи будет показано, как ферроптоз может быть индуцирован в клетках медуллобластомы дикого типа с помощью различных индукторов: эрантина, RSL3 и донора железа. Аналогичным образом, будут использоваться клетки xCT-KO, которые растут в присутствии NAC и которые подвергаются ферроптозу после удаления NAC. Характерный «пузырчатый» фенотип виден под световым микроскопом в течение 12-16 ч с момента запуска ферроптоза. Кроме того, будет использовано окрашивание BODIPY C11 с последующим анализом FACS, чтобы показать накопление гидропероксидов липидов и последующую гибель клеток с использованием метода окрашивания PI. Чтобы доказать ферроптотическую природу клеточной гибели, ферростатин-1 будет использоваться в качестве специфического средства, предотвращающего ферроптоз.

Introduction

Ферроптоз является новым контекстуализированным, зависимым от активных форм кислорода (АФК) типом клеточной смерти1. Помимо АФК, железо играет решающую роль в этом типе клеточной смерти, отсюда и название2. Заключительным и исполнительным этапом ферроптоза является катализируемое железом накопление окислительного повреждения липидов в плазматической мембране, что в конечном итоге приводит к нарушению целостности мембраны и селективной проницаемости и, наконец, к гибели клеток в результате барботирования. Событие гидроперекисного окисления липидов является естественным явлением; Однако его распространению по всей клеточно....

Protocol

Настоящее исследование проводилось с использованием клеточных линий медуллобластомы дикого типа (WT) DAOY, которые культивировали при 37 °C с 5%CO2 в среде DMEM с добавлением 8% FBS. Удаленную xCT клеточную линию поддерживали в тех же условиях, проводя эксперименты в средах с добавлением 1 мМ N-.......

Representative Results

Клеточную линию медуллобластомы DAOY культивировали в стандартной среде DMEM с добавлением 8% FBS до достижения примерно 60% конфлюенции. В день эксперимента были собраны клетки, и 1 000 000 клеток на лунку были помещены в 6-луночные планшеты, согласно таблице 1. На следующий день клетки (в .......

Discussion

Основным признаком гибели ферроптозных клеток является неконтролируемое накопление гидропероксидов липидов в плазматической мембране. Это окислительное повреждение может происходить ферментативным или неферментативным способом, но в любом случае реакция является железозависимой.......

Acknowledgements

Эта работа была поддержана правительством Княжества Монако, а также организацией «Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer» (GEMLUC) и фондом Flavien, который предоставил средства для покупки BD FACS Melody.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BODIPY 581/591 C11Thermo FisherD3861
Cell counterBeckmanCoulter Z1
DMEM medium Gibco10569010
ErastinSigma-AldrichE7781-5MG
Ferroamminium citrateAcros Organics211842500
Ferrostatin-1Sigma-AldrichSML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)Dominique Dutcher500105N1N
Flow CytometerBD BiosciencesFACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermo Fisher11599686
N-acetylcysteineSigma-AldrichA7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection KitInvivoGenrep-pt1
propidium iodideInvitrogenP3566
RSL3Sigma-AldrichSML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mLDominique DutcherX0930-100

References

  1. Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
  2. Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthet....

Explore More Articles

XCTGPx4RSL3BODIPY C111

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved