Выявление ферроптотического фенотипа медуллобластомы

Summary

Содержание гидропероксида липидов является наиболее часто используемым индикатором гибели ферроптозных клеток. В данной статье представлен пошаговый анализ содержания гидропероксида липидов в клетках с помощью проточной цитометрии при индукции ферроптоза.

Abstract

Взаимодействие железа и кислорода является неотъемлемой частью развития жизни на Земле. Тем не менее, эта уникальная химия продолжает очаровывать и озадачивать, приводя к новым биологическим предприятиям. В 2012 году группа из Колумбийского университета признала это взаимодействие центральным событием, ведущим к новому типу регулируемой клеточной смерти, названному «ферроптозом». Основной особенностью ферроптоза является накопление гидропероксидов липидов вследствие (1) дисфункциональной антиоксидантной защиты и/или (2) подавляющего окислительного стресса, который чаще всего совпадает с повышенным содержанием свободного лабильного железа в клетке. Обычно это предотвращается канонической антиферроптозной осью, содержащей транспортер цистина xCT, глутатион (GSH) и пероксидазу GSH 4 (GPx4). Поскольку ферроптоз не является запрограммированным типом клеточной смерти, он не включает в себя сигнальные пути, характерные для апоптоза. Наиболее распространенным способом доказать этот тип клеточной смерти является использование липофильных антиоксидантов (витамин Е, ферростатин-1 и т.д.) для ее предотвращения. Эти молекулы могут приближаться к окислительному повреждению плазматической мембраны и выводить его из токсина. Другим важным аспектом в выявлении ферроптотического фенотипа является обнаружение предшествующего накопления гидропероксидов липидов, для чего используется специфический краситель BODIPY C11. В настоящей рукописи будет показано, как ферроптоз может быть индуцирован в клетках медуллобластомы дикого типа с помощью различных индукторов: эрантина, RSL3 и донора железа. Аналогичным образом, будут использоваться клетки xCT-KO, которые растут в присутствии NAC и которые подвергаются ферроптозу после удаления NAC. Характерный «пузырчатый» фенотип виден под световым микроскопом в течение 12-16 ч с момента запуска ферроптоза. Кроме того, будет использовано окрашивание BODIPY C11 с последующим анализом FACS, чтобы показать накопление гидропероксидов липидов и последующую гибель клеток с использованием метода окрашивания PI. Чтобы доказать ферроптотическую природу клеточной гибели, ферростатин-1 будет использоваться в качестве специфического средства, предотвращающего ферроптоз.

Introduction

Ферроптоз является новым контекстуализированным, зависимым от активных форм кислорода (АФК) типом клеточной смерти¹. Помимо АФК, железо играет решающую роль в этом типе клеточной смерти, отсюда и название². Заключительным и исполнительным этапом ферроптоза является катализируемое железом накопление окислительного повреждения липидов в плазматической мембране, что в конечном итоге приводит к нарушению целостности мембраны и селективной проницаемости и, наконец, к гибели клеток в результате барботирования. Событие гидроперекисного окисления липидов является естественным явлением; Однако его распространению по всей клеточно....

Protocol

Настоящее исследование проводилось с использованием клеточных линий медуллобластомы дикого типа (WT) DAOY, которые культивировали при 37 °C с 5%_CO2 в среде DMEM с добавлением 8% FBS. Удаленную xCT клеточную линию поддерживали в тех же условиях, проводя эксперименты в средах с добавлением 1 мМ N-.......

Discussion

Основным признаком гибели ферроптозных клеток является неконтролируемое накопление гидропероксидов липидов в плазматической мембране. Это окислительное повреждение может происходить ферментативным или неферментативным способом, но в любом случае реакция является железозависимой.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100