Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הדור של אניון סופראוקסיד חיוני לגירוי טסיות הדם, ואם אינו מוסדר, קריטי למחלות טרומבוטיות. כאן, אנו מציגים שלושה פרוטוקולים לזיהוי סלקטיבי של אניונים סופראוקסידים ולחקר ויסות טסיות תלוי חיזור.

Abstract

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות מאוד לא יציבות המכילות חמצן. חוסר היציבות הכימית שלהם הופך אותם לתגובתיים ביותר ומעניק להם את היכולת להגיב עם מולקולות ביולוגיות חשובות כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים. אניונים סופראוקסידים הם ROS חשובים הנוצרים על ידי הפחתת הפחתת חמצן מולקולרית (כלומר, רכישה של אלקטרון אחד). למרות ההשלכה הראשונית שלהם אך ורק על תהליכי הזדקנות, ניוון ופתוגנים, לאחרונה ניכרה השתתפותם בתגובות פיזיולוגיות חשובות. במערכת כלי הדם, אניונים סופראוקסידים הוכחו כמווסתים את ההתמיינות והתפקוד של תאי שריר חלק וסקולריים, את ההתרבות והנדידה של תאי אנדותל וסקולריים באנגיוגנזה, את התגובה החיסונית ואת ההפעלה של טסיות הדם בהמוסטאזיס. תפקידם של אניונים סופראוקסידים חשוב במיוחד בחוסר ויסות של טסיות הדם ובסיבוכים קרדיווסקולריים הקשורים לשפע של מצבים, כולל סרטן, זיהום, דלקת, סוכרת והשמנת יתר. לכן, זה הפך להיות רלוונטי ביותר במחקר הלב וכלי הדם כדי להיות מסוגל למדוד ביעילות את הדור של אניונים superoxide על ידי טסיות אדם, להבין את המנגנונים תלויי חמצון-חיזור המווסתים את האיזון בין hemostasis ופקקת, ובסופו של דבר, לזהות כלים פרמקולוגיים חדשים עבור אפנון של תגובות טסיות המוביל פקקת וסיבוכים קרדיווסקולריים. מחקר זה מציג שלושה פרוטוקולים ניסיוניים שאומצו בהצלחה לזיהוי אניונים סופראוקסידים בטסיות הדם ולחקר המנגנונים תלויי החיזור המווסתים המוסטזיס ופקקת: 1) זיהוי אניון סופראוקסיד מבוסס דיהידרואתידיום (DHE) באמצעות ציטומטריית זרימה; 2) הדמיה וניתוח של אניון סופראוקסיד מבוסס DHE על ידי הדמיה של טסיות יחידות; ו-3) כימות מבוסס ספין פרוב של תפוקת אניון סופראוקסיד בטסיות דם על ידי תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR).

Introduction

אניון סופראוקסיד (O2•-) הוא ה-ROS הרלוונטי ביותר מבחינה תפקודית שנוצר בטסיות1. O2•- הוא תוצר של הפחתת חמצן מולקולרי ומבשר של ROS 2 רבים ושונים. הדימוטציה של O2•- מובילה ליצירת מי חמצן (H2O2) באמצעות תגובות ספונטניות בתמיסה מימית או תגובות המזורזות על ידי דיסמוטאזות סופראוקסיד (SODs 3). למרות שהוצעו מקורות אנזימטיים שונים (למשל, קסנטין אוקסידאז4, ליפאוקסיגנאז5, ציקלואוקסיגנאז6 וחנקן חמצני סינתאז

Protocol

איסוף דם היקפי ממתנדבים בהסכמה מאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית והרשות הלאומית לחקר הבריאות (סימוכין לשירותי בריאות: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. שיטה 1: זיהוי אניון סופראוקסיד באמצעות DHE על ידי ציטומטריית זרימה

  1. תמיסת נתרן ציטראט טרום חמה (37°C) (4% w/v) ולה.......

Representative Results

עבור זיהוי ציטומטריית זרימה של פלואורסצנטיות DHE, אנו מראים תוצאות מייצגות עבור טסיות דם במנוחה (איור 3A) או מגורות עם תרומבין של 0.1 יחידה/מ"ל (איור 3B). תפוקת O2- כומתה כעוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת של טסיות (MFI), כפי שמוצג עבור ?.......

Discussion

בכתב יד זה אנו מציגים שלוש טכניקות שונות בעלות פוטנציאל לקדם את היכולת לחקור את הוויסות תלוי החיזור של תפקוד טסיות הדם באמצעות זיהוי סלקטיבי של O2-. שתי השיטות הראשונות הן שיפור של טכניקות קיימות בגלל בדיקת חמצון-חיזור בשימוש (DHE במקום DCFDA נפוץ יותר אבל ?.......

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי קרן הלב הבריטית (PG/15/40/31522), מחקר אלצהיימר בריטניה (ARUK-PG2017A-3), ומועצת המחקר האירופית (#10102507) מענקי G. Pula.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow cytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagent for EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869For stock solution preparation 
EPR sealing wax platesNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumable for EPR
EPR-grade waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasmaMerck/SigmaF4883For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntibodyBioLegend303704Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumable for incubation in aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385For platelet stimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)Merck/SigmaS5770For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)Labmedics/ChronologP/N 313Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasmaMerck/SigmaT6884For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscopeZeissNAConfocal microscope

References

Explore More Articles

205ROSEPR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved