A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
הדור של אניון סופראוקסיד חיוני לגירוי טסיות הדם, ואם אינו מוסדר, קריטי למחלות טרומבוטיות. כאן, אנו מציגים שלושה פרוטוקולים לזיהוי סלקטיבי של אניונים סופראוקסידים ולחקר ויסות טסיות תלוי חיזור.
מיני חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות מאוד לא יציבות המכילות חמצן. חוסר היציבות הכימית שלהם הופך אותם לתגובתיים ביותר ומעניק להם את היכולת להגיב עם מולקולות ביולוגיות חשובות כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים. אניונים סופראוקסידים הם ROS חשובים הנוצרים על ידי הפחתת הפחתת חמצן מולקולרית (כלומר, רכישה של אלקטרון אחד). למרות ההשלכה הראשונית שלהם אך ורק על תהליכי הזדקנות, ניוון ופתוגנים, לאחרונה ניכרה השתתפותם בתגובות פיזיולוגיות חשובות. במערכת כלי הדם, אניונים סופראוקסידים הוכחו כמווסתים את ההתמיינות והתפקוד של תאי שריר חלק וסקולריים, את ההתרבות והנדידה של תאי אנדותל וסקולריים באנגיוגנזה, את התגובה החיסונית ואת ההפעלה של טסיות הדם בהמוסטאזיס. תפקידם של אניונים סופראוקסידים חשוב במיוחד בחוסר ויסות של טסיות הדם ובסיבוכים קרדיווסקולריים הקשורים לשפע של מצבים, כולל סרטן, זיהום, דלקת, סוכרת והשמנת יתר. לכן, זה הפך להיות רלוונטי ביותר במחקר הלב וכלי הדם כדי להיות מסוגל למדוד ביעילות את הדור של אניונים superoxide על ידי טסיות אדם, להבין את המנגנונים תלויי חמצון-חיזור המווסתים את האיזון בין hemostasis ופקקת, ובסופו של דבר, לזהות כלים פרמקולוגיים חדשים עבור אפנון של תגובות טסיות המוביל פקקת וסיבוכים קרדיווסקולריים. מחקר זה מציג שלושה פרוטוקולים ניסיוניים שאומצו בהצלחה לזיהוי אניונים סופראוקסידים בטסיות הדם ולחקר המנגנונים תלויי החיזור המווסתים המוסטזיס ופקקת: 1) זיהוי אניון סופראוקסיד מבוסס דיהידרואתידיום (DHE) באמצעות ציטומטריית זרימה; 2) הדמיה וניתוח של אניון סופראוקסיד מבוסס DHE על ידי הדמיה של טסיות יחידות; ו-3) כימות מבוסס ספין פרוב של תפוקת אניון סופראוקסיד בטסיות דם על ידי תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR).
אניון סופראוקסיד (O2•-) הוא ה-ROS הרלוונטי ביותר מבחינה תפקודית שנוצר בטסיות1. O2•- הוא תוצר של הפחתת חמצן מולקולרי ומבשר של ROS 2 רבים ושונים. הדימוטציה של O2•- מובילה ליצירת מי חמצן (H2O2) באמצעות תגובות ספונטניות בתמיסה מימית או תגובות המזורזות על ידי דיסמוטאזות סופראוקסיד (SODs 3). למרות שהוצעו מקורות אנזימטיים שונים (למשל, קסנטין אוקסידאז4, ליפאוקסיגנאז5, ציקלואוקסיגנאז6 וחנקן חמצני סינתאז
איסוף דם היקפי ממתנדבים בהסכמה מאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית והרשות הלאומית לחקר הבריאות (סימוכין לשירותי בריאות: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).
1. שיטה 1: זיהוי אניון סופראוקסיד באמצעות DHE על ידי ציטומטריית זרימה
עבור זיהוי ציטומטריית זרימה של פלואורסצנטיות DHE, אנו מראים תוצאות מייצגות עבור טסיות דם במנוחה (איור 3A) או מגורות עם תרומבין של 0.1 יחידה/מ"ל (איור 3B). תפוקת O2•- כומתה כעוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת של טסיות (MFI), כפי שמוצג עבור ?.......
בכתב יד זה אנו מציגים שלוש טכניקות שונות בעלות פוטנציאל לקדם את היכולת לחקור את הוויסות תלוי החיזור של תפקוד טסיות הדם באמצעות זיהוי סלקטיבי של O2•-. שתי השיטות הראשונות הן שיפור של טכניקות קיימות בגלל בדיקת חמצון-חיזור בשימוש (DHE במקום DCFDA נפוץ יותר אבל ?.......
עבודה זו מומנה על ידי קרן הלב הבריטית (PG/15/40/31522), מחקר אלצהיימר בריטניה (ARUK-PG2017A-3), ומועצת המחקר האירופית (#10102507) מענקי G. Pula.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-02.1-50mg | Reagent for EPR (spin probe) |
BD FACSAria III | BD Biosciences | NA | Flow cytometer |
Bovine Serum Albumin | Merck/Sigma | A7030 | For μ-slide coating |
Bruker E-scan M (Noxyscan) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-E.11-BES | EPR spectrometer |
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.) | Merck/Sigma | C4963 | Hydrogen peroxide scavenger (specificity control) |
ChronoLog Model 490+4 | Labmedics/Chronolog | NA | Aggregometer |
CM radical | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-20.1-100mg | Reagent for EPR (calibration control) |
deferoxamine | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-09.1-100mg | Reagent for EPR |
diethyldithiocarbamate (DETC) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-10.1-1g | Reagent for EPR |
Dihydroethidium | Thermo Fisher Scientifics | D11347 | Superoxide anion probe |
Dimethyl sulfoxide | Merck/Sigma | 34869 | For stock solution preparation |
EPR sealing wax plates | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-A.3-VPM | Consumable for EPR |
EPR-grade water | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-07.7.1-0.5L | Reagent for EPR |
Fibrinogen from human plasma | Merck/Sigma | F4883 | For μ-slide coating |
FITC anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303704 | Platelet-specific staining for flow cytometry |
Glass cuvettes | Labmedics/Chronolog | P/N 312 | Consumable for incubation in aggregometer |
Horm Collagen | Labmedics/Chronolog | P/N 385 | For platelet stimulation |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | NA | ImageJ 1.53t (Wayne Rasband) |
Indomethacin | Merck/Sigma | I7378 | For platelet isolation |
Micropipettes DURAN 50µl | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-G.6.1-50µL | Consumable for EPR |
Poly-L-lysine hydrochloride | Merck/Sigma | P2658 | For μ-slide coating |
Prostaglandin E1 (PGE1) | Merck/Sigma | P5515 | For platelet isolation |
Sodium citrate (4% w/v solution) | Merck/Sigma | S5770 | For platelet isolation |
Stirring bars (Teflon-coated) | Labmedics/Chronolog | P/N 313 | Consumable for incubation in aggregometer |
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD) | Merck/Sigma | S9549 | Superoxide anion scavenger (specificity control) |
Thrombin from human plasma | Merck/Sigma | T6884 | For platelet stimulation and μ-slide coating |
VAS2870 | Enzo Life Science | BML-EI395 | NOX inhibitor |
Zeiss 510 LSM confocal microscope | Zeiss | NA | Confocal microscope |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved