שיטות חלופיות לאיתור ייצור אניון סופראוקסיד בטסיות הדם

Summary

הדור של אניון סופראוקסיד חיוני לגירוי טסיות הדם, ואם אינו מוסדר, קריטי למחלות טרומבוטיות. כאן, אנו מציגים שלושה פרוטוקולים לזיהוי סלקטיבי של אניונים סופראוקסידים ולחקר ויסות טסיות תלוי חיזור.

Abstract

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות מאוד לא יציבות המכילות חמצן. חוסר היציבות הכימית שלהם הופך אותם לתגובתיים ביותר ומעניק להם את היכולת להגיב עם מולקולות ביולוגיות חשובות כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים. אניונים סופראוקסידים הם ROS חשובים הנוצרים על ידי הפחתת הפחתת חמצן מולקולרית (כלומר, רכישה של אלקטרון אחד). למרות ההשלכה הראשונית שלהם אך ורק על תהליכי הזדקנות, ניוון ופתוגנים, לאחרונה ניכרה השתתפותם בתגובות פיזיולוגיות חשובות. במערכת כלי הדם, אניונים סופראוקסידים הוכחו כמווסתים את ההתמיינות והתפקוד של תאי שריר חלק וסקולריים, את ההתרבות והנדידה של תאי אנדותל וסקולריים באנגיוגנזה, את התגובה החיסונית ואת ההפעלה של טסיות הדם בהמוסטאזיס. תפקידם של אניונים סופראוקסידים חשוב במיוחד בחוסר ויסות של טסיות הדם ובסיבוכים קרדיווסקולריים הקשורים לשפע של מצבים, כולל סרטן, זיהום, דלקת, סוכרת והשמנת יתר. לכן, זה הפך להיות רלוונטי ביותר במחקר הלב וכלי הדם כדי להיות מסוגל למדוד ביעילות את הדור של אניונים superoxide על ידי טסיות אדם, להבין את המנגנונים תלויי חמצון-חיזור המווסתים את האיזון בין hemostasis ופקקת, ובסופו של דבר, לזהות כלים פרמקולוגיים חדשים עבור אפנון של תגובות טסיות המוביל פקקת וסיבוכים קרדיווסקולריים. מחקר זה מציג שלושה פרוטוקולים ניסיוניים שאומצו בהצלחה לזיהוי אניונים סופראוקסידים בטסיות הדם ולחקר המנגנונים תלויי החיזור המווסתים המוסטזיס ופקקת: 1) זיהוי אניון סופראוקסיד מבוסס דיהידרואתידיום (DHE) באמצעות ציטומטריית זרימה; 2) הדמיה וניתוח של אניון סופראוקסיד מבוסס DHE על ידי הדמיה של טסיות יחידות; ו-3) כימות מבוסס ספין פרוב של תפוקת אניון סופראוקסיד בטסיות דם על ידי תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR).

Introduction

אניון סופראוקסיד (O₂^•-) הוא ה-ROS הרלוונטי ביותר מבחינה תפקודית שנוצר בטסיות¹. O₂^•- הוא תוצר של הפחתת חמצן מולקולרי ומבשר של ROS ² רבים ושונים. הדימוטציה של O₂^•- מובילה ליצירת מי חמצן (H₂O₂) באמצעות תגובות ספונטניות בתמיסה מימית או תגובות המזורזות על ידי דיסמוטאזות סופראוקסיד (^{SODs 3}). למרות שהוצעו מקורות אנזימטיים שונים (למשל, קסנטין אוקסידאז⁴, ליפאוקסיגנאז⁵, ציקלואוקסיגנאז^{6 וחנקן} חמצני סינתאז

Protocol

איסוף דם היקפי ממתנדבים בהסכמה מאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית והרשות הלאומית לחקר הבריאות (סימוכין לשירותי בריאות: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. שיטה 1: זיהוי אניון סופראוקסיד באמצעות DHE על ידי ציטומטריית זרימה

1. תמיסת נתרן ציטראט טרום חמה (37°C) (4% w/v) ולה.......

Discussion

בכתב יד זה אנו מציגים שלוש טכניקות שונות בעלות פוטנציאל לקדם את היכולת לחקור את הוויסות תלוי החיזור של תפקוד טסיות הדם באמצעות זיהוי סלקטיבי של O₂^•-. שתי השיטות הראשונות הן שיפור של טכניקות קיימות בגלל בדיקת חמצון-חיזור בשימוש (DHE במקום DCFDA נפוץ יותר אבל ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope