A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
A geração de ânion superóxido é essencial para a estimulação das plaquetas e, se desregulada, crítica para doenças trombóticas. Aqui, apresentamos três protocolos para a detecção seletiva de ânions superóxido e o estudo da regulação plaquetária dependente de redox.
As espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas contendo oxigênio altamente instáveis. Sua instabilidade química os torna extremamente reativos e lhes dá a capacidade de reagir com moléculas biológicas importantes, como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios. Os ânions superóxido são importantes ROS gerados pela redução da redução molecular de oxigênio (ou seja, aquisição de um elétron). Apesar de sua implicação inicial exclusivamente no envelhecimento, processos degenerativos e patogênicos, sua participação em importantes respostas fisiológicas tornou-se recentemente aparente. No sistema vascular, os ânions superóxido demonstraram modular a diferenciação e a função das células musculares lisas vasculares, a proliferação e migração de células endoteliais vasculares na angiogênese, a resposta imune e a ativação de plaquetas na hemostasia. O papel dos ânions superóxido é particularmente importante na desregulação das plaquetas e nas complicações cardiovasculares associadas a uma infinidade de condições, incluindo câncer, infecção, inflamação, diabetes e obesidade. Tornou-se, portanto, extremamente relevante na pesquisa cardiovascular ser capaz de medir efetivamente a geração de ânions superóxido pelas plaquetas humanas, entender os mecanismos dependentes de redox que regulam o equilíbrio entre hemostasia e trombose e, eventualmente, identificar novas ferramentas farmacológicas para a modulação das respostas plaquetárias levando à trombose e complicações cardiovasculares. Este estudo apresenta três protocolos experimentais adotados com sucesso para a detecção de ânions superóxido em plaquetas e o estudo dos mecanismos dependentes de redox que regulam a hemostasia e a trombose: 1) detecção de ânion superóxido à base de dihidroetídio (DHE) por citometria de fluxo; 2) visualização e análise de ânions superóxido baseados em DHE por imagem plaquetária única; e 3) quantificação baseada em sonda de spin da saída de ânions superóxido em plaquetas por ressonância paramagnética eletrônica (EPR).
O ânion superóxido (O2•-) é o ROS mais funcionalmente relevante gerado nas plaquetas1. O2•- é o produto da redução do oxigênio molecular e o precursor de muitas ROS 2 diferentes. A dismutação de O2•- leva à geração de peróxido de hidrogênio (H2O2) por meio de reações espontâneas em solução aquosa ou reações catalisadas por superóxido dismutases (SODs3). Embora diferentes fontes enzimáticas tenham sido sugeridas (por exemplo, xantina oxidase4, lipoxigenas....
A coleta de sangue periférico de voluntários consentidos é aprovada pelo Comitê de Ética local e pela Autoridade Nacional de Pesquisa em Saúde do Serviço de Saúde (referência REC: 21/SC/0215; ID IRAS: 283854).
1. Método 1: Deteção de aniões superóxidos utilizando DHE por citometria de fluxo
Para detecção de fluorescência DHE por citometria de fluxo, mostramos resultados representativos para plaquetas em repouso (Figura 3A) ou estimuladas com 0,1 unidade/mL de trombina (Figura 3B). A saída de O2•- foi quantificada como intensidade média de fluorescência plaquetária (MFI), conforme mostrado para estimulação com 0,1 unidade/mL de trombina (Figura 3C
Neste manuscrito, apresentamos três técnicas diferentes com o potencial de avançar na capacidade de investigar a regulação dependente de redox da função plaquetária por meio da detecção seletiva de O2•-. Os dois primeiros métodos são uma melhoria nas técnicas existentes devido à sonda redox utilizada (DHE em vez do DCFDA mais comum, mas menos confiável). Essas técnicas são, portanto, facilmente acessíveis e a maioria dos laboratórios .......
Os autores não têm nada a divulgar.
Este trabalho foi financiado pela British Heart Foundation (PG / 15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) e European Research Council (# 10102507) para G. Pula.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-02.1-50mg | Reagent for EPR (spin probe) |
BD FACSAria III | BD Biosciences | NA | Flow cytometer |
Bovine Serum Albumin | Merck/Sigma | A7030 | For μ-slide coating |
Bruker E-scan M (Noxyscan) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-E.11-BES | EPR spectrometer |
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.) | Merck/Sigma | C4963 | Hydrogen peroxide scavenger (specificity control) |
ChronoLog Model 490+4 | Labmedics/Chronolog | NA | Aggregometer |
CM radical | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-20.1-100mg | Reagent for EPR (calibration control) |
deferoxamine | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-09.1-100mg | Reagent for EPR |
diethyldithiocarbamate (DETC) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-10.1-1g | Reagent for EPR |
Dihydroethidium | Thermo Fisher Scientifics | D11347 | Superoxide anion probe |
Dimethyl sulfoxide | Merck/Sigma | 34869 | For stock solution preparation |
EPR sealing wax plates | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-A.3-VPM | Consumable for EPR |
EPR-grade water | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-07.7.1-0.5L | Reagent for EPR |
Fibrinogen from human plasma | Merck/Sigma | F4883 | For μ-slide coating |
FITC anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303704 | Platelet-specific staining for flow cytometry |
Glass cuvettes | Labmedics/Chronolog | P/N 312 | Consumable for incubation in aggregometer |
Horm Collagen | Labmedics/Chronolog | P/N 385 | For platelet stimulation |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | NA | ImageJ 1.53t (Wayne Rasband) |
Indomethacin | Merck/Sigma | I7378 | For platelet isolation |
Micropipettes DURAN 50µl | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-G.6.1-50µL | Consumable for EPR |
Poly-L-lysine hydrochloride | Merck/Sigma | P2658 | For μ-slide coating |
Prostaglandin E1 (PGE1) | Merck/Sigma | P5515 | For platelet isolation |
Sodium citrate (4% w/v solution) | Merck/Sigma | S5770 | For platelet isolation |
Stirring bars (Teflon-coated) | Labmedics/Chronolog | P/N 313 | Consumable for incubation in aggregometer |
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD) | Merck/Sigma | S9549 | Superoxide anion scavenger (specificity control) |
Thrombin from human plasma | Merck/Sigma | T6884 | For platelet stimulation and μ-slide coating |
VAS2870 | Enzo Life Science | BML-EI395 | NOX inhibitor |
Zeiss 510 LSM confocal microscope | Zeiss | NA | Confocal microscope |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved