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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A geração de ânion superóxido é essencial para a estimulação das plaquetas e, se desregulada, crítica para doenças trombóticas. Aqui, apresentamos três protocolos para a detecção seletiva de ânions superóxido e o estudo da regulação plaquetária dependente de redox.

Abstract

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas contendo oxigênio altamente instáveis. Sua instabilidade química os torna extremamente reativos e lhes dá a capacidade de reagir com moléculas biológicas importantes, como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios. Os ânions superóxido são importantes ROS gerados pela redução da redução molecular de oxigênio (ou seja, aquisição de um elétron). Apesar de sua implicação inicial exclusivamente no envelhecimento, processos degenerativos e patogênicos, sua participação em importantes respostas fisiológicas tornou-se recentemente aparente. No sistema vascular, os ânions superóxido demonstraram modular a diferenciação e a função das células musculares lisas vasculares, a proliferação e migração de células endoteliais vasculares na angiogênese, a resposta imune e a ativação de plaquetas na hemostasia. O papel dos ânions superóxido é particularmente importante na desregulação das plaquetas e nas complicações cardiovasculares associadas a uma infinidade de condições, incluindo câncer, infecção, inflamação, diabetes e obesidade. Tornou-se, portanto, extremamente relevante na pesquisa cardiovascular ser capaz de medir efetivamente a geração de ânions superóxido pelas plaquetas humanas, entender os mecanismos dependentes de redox que regulam o equilíbrio entre hemostasia e trombose e, eventualmente, identificar novas ferramentas farmacológicas para a modulação das respostas plaquetárias levando à trombose e complicações cardiovasculares. Este estudo apresenta três protocolos experimentais adotados com sucesso para a detecção de ânions superóxido em plaquetas e o estudo dos mecanismos dependentes de redox que regulam a hemostasia e a trombose: 1) detecção de ânion superóxido à base de dihidroetídio (DHE) por citometria de fluxo; 2) visualização e análise de ânions superóxido baseados em DHE por imagem plaquetária única; e 3) quantificação baseada em sonda de spin da saída de ânions superóxido em plaquetas por ressonância paramagnética eletrônica (EPR).

Introduction

O ânion superóxido (O2•-) é o ROS mais funcionalmente relevante gerado nas plaquetas1. O2•- é o produto da redução do oxigênio molecular e o precursor de muitas ROS 2 diferentes. A dismutação de O2•- leva à geração de peróxido de hidrogênio (H2O2) por meio de reações espontâneas em solução aquosa ou reações catalisadas por superóxido dismutases (SODs3). Embora diferentes fontes enzimáticas tenham sido sugeridas (por exemplo, xantina oxidase4, lipoxigenas....

Protocol

A coleta de sangue periférico de voluntários consentidos é aprovada pelo Comitê de Ética local e pela Autoridade Nacional de Pesquisa em Saúde do Serviço de Saúde (referência REC: 21/SC/0215; ID IRAS: 283854).

1. Método 1: Deteção de aniões superóxidos utilizando DHE por citometria de fluxo

  1. Pré-aqueça (37 °C) a solução de citrato de sódio (4% p/v) e use-a como anticoagulante, adicionando-a diretamente ao sangue no.......

Representative Results

Para detecção de fluorescência DHE por citometria de fluxo, mostramos resultados representativos para plaquetas em repouso (Figura 3A) ou estimuladas com 0,1 unidade/mL de trombina (Figura 3B). A saída de O2- foi quantificada como intensidade média de fluorescência plaquetária (MFI), conforme mostrado para estimulação com 0,1 unidade/mL de trombina (Figura 3C

Discussion

Neste manuscrito, apresentamos três técnicas diferentes com o potencial de avançar na capacidade de investigar a regulação dependente de redox da função plaquetária por meio da detecção seletiva de O2-. Os dois primeiros métodos são uma melhoria nas técnicas existentes devido à sonda redox utilizada (DHE em vez do DCFDA mais comum, mas menos confiável). Essas técnicas são, portanto, facilmente acessíveis e a maioria dos laboratórios .......

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela British Heart Foundation (PG / 15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) e European Research Council (# 10102507) para G. Pula.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow cytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagent for EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869For stock solution preparation 
EPR sealing wax platesNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumable for EPR
EPR-grade waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasmaMerck/SigmaF4883For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntibodyBioLegend303704Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumable for incubation in aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385For platelet stimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)Merck/SigmaS5770For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)Labmedics/ChronologP/N 313Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasmaMerck/SigmaT6884For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscopeZeissNAConfocal microscope

References

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