Métodos alternativos para a detecção da geração de ânions superóxido em plaquetas

Summary

A geração de ânion superóxido é essencial para a estimulação das plaquetas e, se desregulada, crítica para doenças trombóticas. Aqui, apresentamos três protocolos para a detecção seletiva de ânions superóxido e o estudo da regulação plaquetária dependente de redox.

Abstract

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas contendo oxigênio altamente instáveis. Sua instabilidade química os torna extremamente reativos e lhes dá a capacidade de reagir com moléculas biológicas importantes, como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios. Os ânions superóxido são importantes ROS gerados pela redução da redução molecular de oxigênio (ou seja, aquisição de um elétron). Apesar de sua implicação inicial exclusivamente no envelhecimento, processos degenerativos e patogênicos, sua participação em importantes respostas fisiológicas tornou-se recentemente aparente. No sistema vascular, os ânions superóxido demonstraram modular a diferenciação e a função das células musculares lisas vasculares, a proliferação e migração de células endoteliais vasculares na angiogênese, a resposta imune e a ativação de plaquetas na hemostasia. O papel dos ânions superóxido é particularmente importante na desregulação das plaquetas e nas complicações cardiovasculares associadas a uma infinidade de condições, incluindo câncer, infecção, inflamação, diabetes e obesidade. Tornou-se, portanto, extremamente relevante na pesquisa cardiovascular ser capaz de medir efetivamente a geração de ânions superóxido pelas plaquetas humanas, entender os mecanismos dependentes de redox que regulam o equilíbrio entre hemostasia e trombose e, eventualmente, identificar novas ferramentas farmacológicas para a modulação das respostas plaquetárias levando à trombose e complicações cardiovasculares. Este estudo apresenta três protocolos experimentais adotados com sucesso para a detecção de ânions superóxido em plaquetas e o estudo dos mecanismos dependentes de redox que regulam a hemostasia e a trombose: 1) detecção de ânion superóxido à base de dihidroetídio (DHE) por citometria de fluxo; 2) visualização e análise de ânions superóxido baseados em DHE por imagem plaquetária única; e 3) quantificação baseada em sonda de spin da saída de ânions superóxido em plaquetas por ressonância paramagnética eletrônica (EPR).

Introduction

O ânion superóxido (O₂^•-) é o ROS mais funcionalmente relevante gerado nas plaquetas¹. O₂^•- é o produto da redução do oxigênio molecular e o precursor de muitas ROS ² diferentes. A dismutação de O₂^•- leva à geração de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) por meio de reações espontâneas em solução aquosa ou reações catalisadas por superóxido dismutases (SODs³). Embora diferentes fontes enzimáticas tenham sido sugeridas (por exemplo, xantina oxidase⁴, lipoxigenas....

Protocol

A coleta de sangue periférico de voluntários consentidos é aprovada pelo Comitê de Ética local e pela Autoridade Nacional de Pesquisa em Saúde do Serviço de Saúde (referência REC: 21/SC/0215; ID IRAS: 283854).

1. Método 1: Deteção de aniões superóxidos utilizando DHE por citometria de fluxo

1. Pré-aqueça (37 °C) a solução de citrato de sódio (4% p/v) e use-a como anticoagulante, adicionando-a diretamente ao sangue no.......

Discussion

Neste manuscrito, apresentamos três técnicas diferentes com o potencial de avançar na capacidade de investigar a regulação dependente de redox da função plaquetária por meio da detecção seletiva de O₂^•-. Os dois primeiros métodos são uma melhoria nas técnicas existentes devido à sonda redox utilizada (DHE em vez do DCFDA mais comum, mas menos confiável). Essas técnicas são, portanto, facilmente acessíveis e a maioria dos laboratórios .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope