A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Образование супероксид-аниона имеет важное значение для стимуляции тромбоцитов и, в случае его нерегуляции, имеет решающее значение для тромботических заболеваний. В данной работе мы представляем три протокола для селективного детектирования супероксид-анионов и изучения редокс-зависимой регуляции тромбоцитов.
Активные формы кислорода (АФК) представляют собой крайне нестабильные молекулы, содержащие кислород. Их химическая нестабильность делает их чрезвычайно реактивными и дает им способность реагировать с важными биологическими молекулами, такими как белки, нуклеиновые кислоты и липиды. Супероксидные анионы являются важными АФК, образующимися при восстановлении молекулярного восстановления кислорода (т.е. приобретении одного электрона). Несмотря на то, что первоначально они участвовали исключительно в старении, дегенеративных и патогенных процессах, в последнее время их участие в важных физиологических реакциях стало очевидным. Было показано, что в сосудистой системе супероксид-анионы модулируют дифференцировку и функцию гладкомышечных клеток сосудов, пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток сосудов в ангиогенезе, иммунный ответ и активацию тромбоцитов в гемостазе. Роль супероксид-анионов особенно важна в нарушении регуляции тромбоцитов и сердечно-сосудистых осложнениях, связанных с множеством заболеваний, включая рак, инфекции, воспаления, диабет и ожирение. Таким образом, в сердечно-сосудистых исследованиях стало чрезвычайно актуальным иметь возможность эффективно измерять образование супероксид-анионов тромбоцитами человека, понимать редокс-зависимые механизмы, регулирующие баланс между гемостазом и тромбозом, и, в конечном итоге, идентифицировать новые фармакологические инструменты для модуляции тромбоцитарных реакций, ведущих к тромбозу и сердечно-сосудистым осложнениям. В данном исследовании представлены три экспериментальных протокола, успешно принятых для обнаружения супероксид-анионов в тромбоцитах и изучения редокс-зависимых механизмов, регулирующих гемостаз и тромбоз: 1) обнаружение супероксид-анионов на основе дигидроэтидия (ДГЭ) методом проточной цитометрии; 2) Визуализация и анализ супероксид-анионов на основе ДГЭ с помощью визуализации одиночных тромбоцитов; и 3) количественное определение выхода супероксид-анионов в тромбоцитах с помощью электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) на основе спинового зонда.
Супероксид-анион (O2•-) является наиболее функционально значимым АФК, образующимся в тромбоцитах1. O2•- является продуктом восстановления молекулярного кислорода и предшественником многих различных АФК 2. Дисмутация O2•- приводит к образованию перекиси водорода (H2O2) в результате спонтанных реакций в водном растворе или реакций, катализируемых супероксиддисмутазами (SODs3). Несмотря на то, что были предложены различные ферментативные источники (например, ксантиноксидаза
Забор периферической крови у добровольцев по обоюдному согласию одобрен местным Комитетом по этике и Национальным управлением по исследованиям в области здравоохранения Национальной службы здравоохранения (ссылка REC: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).
1. Метод 1: Обн.......
Для определения флуоресценции DHE с помощью проточной цитометрии мы показываем репрезентативные результаты для тромбоцитов, находящихся либо в состоянии покоя (рис. 3A), либо стимулированных тромбином 0,1 ЕД/мл (рис. 3B). Выход O2•
В этой рукописи мы представляем три различных метода, которые могут расширить возможности исследования редокс-зависимой регуляции функции тромбоцитов посредством селективного обнаружения O2•-. Первые два метода являются улучшением существующих м?.......
Эта работа финансировалась грантами Британского фонда сердца (PG/15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) и Европейского исследовательского совета (#10102507).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-02.1-50mg | Reagent for EPR (spin probe) |
BD FACSAria III | BD Biosciences | NA | Flow cytometer |
Bovine Serum Albumin | Merck/Sigma | A7030 | For μ-slide coating |
Bruker E-scan M (Noxyscan) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-E.11-BES | EPR spectrometer |
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.) | Merck/Sigma | C4963 | Hydrogen peroxide scavenger (specificity control) |
ChronoLog Model 490+4 | Labmedics/Chronolog | NA | Aggregometer |
CM radical | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-20.1-100mg | Reagent for EPR (calibration control) |
deferoxamine | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-09.1-100mg | Reagent for EPR |
diethyldithiocarbamate (DETC) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-10.1-1g | Reagent for EPR |
Dihydroethidium | Thermo Fisher Scientifics | D11347 | Superoxide anion probe |
Dimethyl sulfoxide | Merck/Sigma | 34869 | For stock solution preparation |
EPR sealing wax plates | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-A.3-VPM | Consumable for EPR |
EPR-grade water | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-07.7.1-0.5L | Reagent for EPR |
Fibrinogen from human plasma | Merck/Sigma | F4883 | For μ-slide coating |
FITC anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303704 | Platelet-specific staining for flow cytometry |
Glass cuvettes | Labmedics/Chronolog | P/N 312 | Consumable for incubation in aggregometer |
Horm Collagen | Labmedics/Chronolog | P/N 385 | For platelet stimulation |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | NA | ImageJ 1.53t (Wayne Rasband) |
Indomethacin | Merck/Sigma | I7378 | For platelet isolation |
Micropipettes DURAN 50µl | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-G.6.1-50µL | Consumable for EPR |
Poly-L-lysine hydrochloride | Merck/Sigma | P2658 | For μ-slide coating |
Prostaglandin E1 (PGE1) | Merck/Sigma | P5515 | For platelet isolation |
Sodium citrate (4% w/v solution) | Merck/Sigma | S5770 | For platelet isolation |
Stirring bars (Teflon-coated) | Labmedics/Chronolog | P/N 313 | Consumable for incubation in aggregometer |
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD) | Merck/Sigma | S9549 | Superoxide anion scavenger (specificity control) |
Thrombin from human plasma | Merck/Sigma | T6884 | For platelet stimulation and μ-slide coating |
VAS2870 | Enzo Life Science | BML-EI395 | NOX inhibitor |
Zeiss 510 LSM confocal microscope | Zeiss | NA | Confocal microscope |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved