Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Образование супероксид-аниона имеет важное значение для стимуляции тромбоцитов и, в случае его нерегуляции, имеет решающее значение для тромботических заболеваний. В данной работе мы представляем три протокола для селективного детектирования супероксид-анионов и изучения редокс-зависимой регуляции тромбоцитов.

Abstract

Активные формы кислорода (АФК) представляют собой крайне нестабильные молекулы, содержащие кислород. Их химическая нестабильность делает их чрезвычайно реактивными и дает им способность реагировать с важными биологическими молекулами, такими как белки, нуклеиновые кислоты и липиды. Супероксидные анионы являются важными АФК, образующимися при восстановлении молекулярного восстановления кислорода (т.е. приобретении одного электрона). Несмотря на то, что первоначально они участвовали исключительно в старении, дегенеративных и патогенных процессах, в последнее время их участие в важных физиологических реакциях стало очевидным. Было показано, что в сосудистой системе супероксид-анионы модулируют дифференцировку и функцию гладкомышечных клеток сосудов, пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток сосудов в ангиогенезе, иммунный ответ и активацию тромбоцитов в гемостазе. Роль супероксид-анионов особенно важна в нарушении регуляции тромбоцитов и сердечно-сосудистых осложнениях, связанных с множеством заболеваний, включая рак, инфекции, воспаления, диабет и ожирение. Таким образом, в сердечно-сосудистых исследованиях стало чрезвычайно актуальным иметь возможность эффективно измерять образование супероксид-анионов тромбоцитами человека, понимать редокс-зависимые механизмы, регулирующие баланс между гемостазом и тромбозом, и, в конечном итоге, идентифицировать новые фармакологические инструменты для модуляции тромбоцитарных реакций, ведущих к тромбозу и сердечно-сосудистым осложнениям. В данном исследовании представлены три экспериментальных протокола, успешно принятых для обнаружения супероксид-анионов в тромбоцитах и изучения редокс-зависимых механизмов, регулирующих гемостаз и тромбоз: 1) обнаружение супероксид-анионов на основе дигидроэтидия (ДГЭ) методом проточной цитометрии; 2) Визуализация и анализ супероксид-анионов на основе ДГЭ с помощью визуализации одиночных тромбоцитов; и 3) количественное определение выхода супероксид-анионов в тромбоцитах с помощью электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) на основе спинового зонда.

Introduction

Супероксид-анион (O2•-) является наиболее функционально значимым АФК, образующимся в тромбоцитах1. O2•- является продуктом восстановления молекулярного кислорода и предшественником многих различных АФК 2. Дисмутация O2•- приводит к образованию перекиси водорода (H2O2) в результате спонтанных реакций в водном растворе или реакций, катализируемых супероксиддисмутазами (SODs3). Несмотря на то, что были предложены различные ферментативные источники (например, ксантиноксидаза

Protocol

Забор периферической крови у добровольцев по обоюдному согласию одобрен местным Комитетом по этике и Национальным управлением по исследованиям в области здравоохранения Национальной службы здравоохранения (ссылка REC: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. Метод 1: Обн.......

Representative Results

Для определения флуоресценции DHE с помощью проточной цитометрии мы показываем репрезентативные результаты для тромбоцитов, находящихся либо в состоянии покоя (рис. 3A), либо стимулированных тромбином 0,1 ЕД/мл (рис. 3B). Выход O2

Discussion

В этой рукописи мы представляем три различных метода, которые могут расширить возможности исследования редокс-зависимой регуляции функции тромбоцитов посредством селективного обнаружения O2-. Первые два метода являются улучшением существующих м?.......

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась грантами Британского фонда сердца (PG/15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) и Европейского исследовательского совета (#10102507).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow cytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagent for EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869For stock solution preparation 
EPR sealing wax platesNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumable for EPR
EPR-grade waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasmaMerck/SigmaF4883For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntibodyBioLegend303704Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumable for incubation in aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385For platelet stimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)Merck/SigmaS5770For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)Labmedics/ChronologP/N 313Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasmaMerck/SigmaT6884For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscopeZeissNAConfocal microscope

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved