Paradigmas para Avaliação Comportamental no Modelo de Drosophila de Transtorno do Espectro do Autismo

Summary

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) está associado ao comportamento social e comunicativo prejudicado e ao surgimento de comportamento repetitivo. Para estudar a inter-relação entre genes de TEA e déficits comportamentais no modelo de Drosophila , cinco paradigmas comportamentais são descritos neste artigo para testar o espaçamento social, agressão, namoro, aliciamento e comportamento de habituação.

Abstract

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) engloba um grupo heterogêneo de transtornos do neurodesenvolvimento com sintomas comportamentais comuns, incluindo déficits na interação social e capacidade de comunicação, comportamentos restritos ou repetitivos aprimorados e também, em alguns casos, dificuldade de aprendizagem e déficit motor. Drosophila serviu como um organismo modelo incomparável para modelar um grande número de doenças humanas. Como muitos genes foram implicados no TEA, as moscas-das-frutas surgiram como uma maneira poderosa e eficiente de testar os genes supostamente envolvidos com o distúrbio. Como centenas de genes, com papéis funcionais variados, estão implicados no TEA, um único modelo genético de TEA é inviável; em vez disso, mutantes genéticos individuais, knockdowns de genes ou estudos baseados em superexpressão dos homólogos de moscas de genes associados ao TEA são os meios comuns para obter informações sobre as vias moleculares subjacentes a esses produtos gênicos. Uma série de técnicas comportamentais estão disponíveis em Drosophila , que fornecem fácil leitura de déficits em componentes comportamentais específicos. O ensaio de espaço social e os ensaios de agressão e namoro em moscas têm se mostrado úteis na avaliação de defeitos na interação social ou comunicação. O comportamento de higiene em moscas é uma excelente leitura do comportamento repetitivo. O ensaio de habituação é usado em moscas para estimar a capacidade de aprendizado de habituação, que é afetada em alguns pacientes com TEA. Uma combinação desses paradigmas comportamentais pode ser utilizada para fazer uma avaliação completa do estado da doença semelhante ao TEA humano em moscas. Usando moscas mutantes Fmr1 , recapitulando a síndrome do X frágil em humanos e knockdown de linha homóloga a POGZ em neurônios de moscas, mostramos déficits quantificáveis no espaçamento social, agressão, comportamento de cortejo, comportamento de higiene e habituação. Esses paradigmas comportamentais são demonstrados aqui em suas formas mais simples e diretas, com a suposição de que isso facilitaria seu uso generalizado para pesquisas sobre TEA e outros distúrbios do neurodesenvolvimento em modelos de moscas.

Introduction

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) engloba um grupo heterogêneo de distúrbios neurológicos. Inclui uma série de distúrbios complexos do neurodesenvolvimento caracterizados por déficits multicontextuais e persistentes na comunicação social e interação social e a presença de padrões e interesses comportamentais e de atividade restritos e repetitivos¹. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), 1 em cada 100 crianças é diagnosticada com TEA em todo o mundo, com uma proporção de homens para mulheres de 4,2². A doença torna-se evidente no segundo ou terceiro ano de vida. Crianças com TEA mostram falta de inter....

Protocol

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e reagentes usados neste protocolo.

1. Ensaio de agressão

1. Preparando a arena de ensaio de agressão
   1. Pegue uma placa padrão de 24 poços (Figura 1A) e use cada poço da placa como uma única 'arena' (Figura 1B) para a agressão da mosca. Encha metade de cada poço com comida normal para moscas e deix.......

Discussion

A Drosophila é usada como um organismo modelo fino para pesquisa em distúrbios neurológicos humanos devido a um alto grau de conservação de sequências gênicas entre genes de moscas e doenças humanas⁹. Numerosos paradigmas comportamentais robustos o tornam um modelo atraente para estudar fenótipos manifestados em mutantes que recapitulam doenças humanas. Como centenas de genes estão implicados no transtorno do espectro do autismo (TEA), não existe um modelo comum de TEA em nenh.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene			12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheet			Alternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips			19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizes			Thickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapes			i) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel			10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambers			x2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vial			Perspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottles			Borosil #1500017
Gas washing stopper			Borosil #1761021
Glass vial			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)			Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) light			SRL #18211
Roller clamps			Polymed #14098
Silicone tubes			OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pump			Hana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-maze			Borosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)			Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)			https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottles			OD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vials			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism software			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ software			https://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set up			Camcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
Cotton			Absorbent, autoclaved
Parafilm			Sigma-aldrich #P7793
Pipette tips			200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tube			length= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)			SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)			Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)			SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)			SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)			SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)			SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)			HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)			BDSC # 64349
w1118			BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]			BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]			BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)			BDSC # 50742
LN1-GAL4			NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNA			BDSC # 25971