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本文内容

  • 摘要
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  • 结果
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  • 参考文献
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摘要

自闭症谱系障碍 （ASD） 与社交和交际行为受损以及重复行为的出现有关。为了研究 果蝇 模型中 ASD 基因与行为缺陷之间的相互关系，本文描述了五种行为范式，用于分析社交间距、攻击性、求偶、梳理和习惯化行为。

摘要

自闭症谱系障碍 （ASD） 包括一组异质性的神经发育障碍，具有常见的行为症状，包括社交互动和沟通能力缺陷、受限或重复行为增强，以及在某些情况下学习障碍和运动缺陷。 果蝇 已成为模拟大量人类疾病的无与伦比的模式生物。由于许多基因与 ASD 有关，果蝇已成为一种强大而有效的方法来测试推测与该疾病有关的基因。由于数百个具有不同功能作用的基因与 ASD 有关，因此 ASD 的单一遗传果蝇模型是不可行的;相反，ASD 相关基因的果蝇同源物的个体遗传突变体、基因敲低或基于过表达的研究是深入了解这些基因产物背后的分子途径的常用方法。 果蝇 中有许多行为技术可用，可以轻松读取特定行为成分的缺陷。果蝇的社会空间测定和攻击性和求偶测定已被证明可用于评估社交互动或交流的缺陷。苍蝇的梳理行为是重复行为的极好读数。习惯化测定用于果蝇以估计习惯化学习的能力，发现一些 ASD 患者会受到影响。这些行为范式的组合可用于对果蝇的人类 ASD 样疾病状态进行全面评估。使用 Fmr1 突变果蝇，概括人类的脆性 X 综合征，以及果蝇神经元中的 POGZ 同源 物行 敲除，我们显示了社交间距、攻击性、求偶行为、梳理行为和习惯化方面的可量化缺陷。这些行为范式在这里以最简单和直接的形式进行演示，并假设这将促进它们广泛用于 ASD 和果蝇模型中其他神经发育障碍的研究。

引言

自闭症谱系障碍 （ASD） 包括一组异质性的神经系统疾病。它包括一系列复杂的神经发育障碍，其特征是社交沟通和社会互动中的多情境和持续缺陷，以及存在受限、重复的行为和活动模式和兴趣1。根据世界卫生组织 （WHO） 的数据，全球每 100 名儿童中就有 1 名被诊断出患有 ASD，男女比例为 4.22。这种疾病在出生后的第二年或第三年变得明显。ASD 儿童表现出对社会情感互惠、非语言交流和人际关系技能缺乏兴趣。他们表现出重复的行为，如刻板的运动、僵化和仪式化的例行公事，以及对受限兴趣的强烈关注。房间隔缺损儿童对触觉、嗅觉、声音和味觉表现出高度的反应，而疼痛和温度反应相对较低1。这种疾病的外显率在患有 ASD 的不同患者中也不同，因此变异性增加。

目前 ASD 的临床诊断基于个体的行为评估，因为没有涵盖所有形式的 ASD3 的基于生物标志物的确认性或常见的基因测试。破译遗传和神经生理学基础将有助于靶向治疗策略。在过去的十年中，大量的研究导致鉴定出数百个基因在 ASD 患者中被删除或突变，或者其表达水平发生改变。正在进行的研究强调使用小鼠或果蝇等模式生物来验证这些候选基因的贡献，其中，这些基因被敲除或敲低，然后测试 ASD 样行为缺陷并阐明导致异常的潜在遗传和分子途径。概括人类染色体基因座 16p11.2 中拷贝数变异 （CNV） 的小鼠模型显示了一些 ASD 行为缺陷 4,5,6。产前暴露于致畸药物丙戊酸 （VPA） 是另一种小鼠模型，其特征类似于人类 ASD 7,8。此外，还存在一系列表现出遗传综合征相关自闭症的小鼠模型，例如，由 Fmr1、Pten、Mecp2、Cacna1c 突变引起的单基因综合征模型，以及由 Cntnap2、Shank、Neurexin 或 Neuroligin 基因5 等基因突变引起的单基因非综合征模型。

果蝇（黑腹果蝇）是另一种重要的模式生物，用于研究包括 ASD 在内的大量人类疾病9 的细胞、分子和遗传基础。果蝇和人类在分子、细胞和突触水平上共享高度保守的生物过程。果蝇已成功用于 ASD 研究 10,11,12 来表征与 ASD 相关的基因，并破译它们在突触发生、突触功能和可塑性、神经回路组装和成熟中的确切作用;发现 ASD 相关基因的果蝇同源物在调节社交和/或重复行为中发挥作用 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21。果蝇还用作筛选 ASD 基因及其变体的模型 15,22,23。果蝇 ASD 研究的最大挑战是，与其他疾病模型不同，没有单一的 ASD 果蝇模型。为了了解特定 ASD 基因突变或敲低的影响，研究人员需要验证行为表型是否充分模拟 ASD 患者的症状，然后继续了解表型的分子或生理基础。

因此，ASD 样表型的检测对于果蝇模型中的 ASD 研究至关重要。多年来，出现了一些行为技术，使我们能够检测异常情况，例如社交行为/互动、沟通、重复行为和对刺激的反应缺陷。此外，这些行为技术已在不同的实验室中进行了多次修改和升级，以满足特定要求，例如放大、检测自动化、读数、定量和比较方法。在本视频文章中，演示了五种行为范式的最基本版本，它们结合起来，可以用于以最简单的方式检测类似 ASD 的行为结果。

攻击性是一种进化上保守的先天行为，影响生存和繁殖24。对同种动物的攻击性行为受“社交动机”25,26 和“沟通”27 的影响，这两者都在受 ASD 影响的个体中受到损害。果蝇中对攻击性行为进行了很好的描述，其通过稳健的攻击性测定 28,29,30 和众所周知的遗传学和神经生物学基础31 的可量化性使其成为评估果蝇模型中 ASD 表型的合适行为范式32。攻击性受到远离社会环境的社会孤立的影响，这会导致攻击性增强;当雄性苍蝇被隔离几天时，也观察到了同样的情况33,34。另一种量化果蝇社交性的行为测定法是社会空间测定法35，它测量一小群果蝇中最近邻居之间的距离和果蝇间的距离，使其非常适合测试 ASD 基因直系同源物在果蝇12、21、36、37 以及环境诱导的 ASD 果蝇模型中的作用38，39.

果蝇求偶测定是另一种行为范式，经常用于测定回路或基因操作后社交和沟通技能的改变，包括自闭症相关基因18、19、21、40。重复的行为模式在 ASD 患者中很普遍，这在果蝇中通过梳理行为概括起来——为清洁和其他目的而进行的一系列不同的、刻板的动作。它已成功用于测定 ASD 基因突变对果蝇的影响 21,41 以及暴露于化学物质38,39。在 16,41,42,43 之前已经描述了该测定的多项进步和自动化;在这里，我们演示了最基本的检测模式，它易于采用和量化。

已知 ASD 会影响一些患者的习惯化、学习和记忆能力44、45、46、47、48、49、50、ASD 模式生物51、52，还会导致不同嗅觉行为的缺陷50。果蝇 light-off jump habituation 以前曾用于筛选 ASD 基因23。习惯化可以通过嗅觉习惯化测定 53,54,55 的简单方法进行测定。我们描述了诱导嗅觉习惯化的方法，并使用经典的基于 Y 迷宫的二元气味选择测定法56 测定结果，该测定法可用于检测 ASD 基因突变体或基因敲低条件下的习惯化缺陷。为了评估突变（或基因敲低）或药物治疗对果蝇行为的影响是否构成 ASD 样表型，可以结合使用此处描述的这 5 种检测方法。

研究方案

有关本协议中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 攻击性试验

  1. 准备攻击性试验领域
    1. 取一个标准的 24 孔板（图 1A），并将板的每个孔用作苍蝇攻击的单个“竞技场”（图 1B）。在每个井中装满普通苍蝇食物的一半，并使其干燥过夜。
      注意：或者，竞技场中可能包括一个攻击性的焦点，例如一点酵母糊或被斩首的雌性，以确保雄性攻击性。
    2. 取任何透明的塑料/亚克力板，足以覆盖大约三到四个孔的表面。在片材上穿孔，形成直径为 ~2.5 mm 的小孔，以便通过它将单个果蝇插入孔中。
  2. 准备苍蝇吸气器
    1. 取一根 30-50 厘米长的橡胶/硅胶管（图 1C1）。
    2. 取 200 μL（或 1,000 μL）移液器吸头，从窄吸头切下 ~1 cm。将切割端插入橡胶管的一端;这个尖端将是“嘴端”，用于基于嘴的抽吸。
    3. 取另一个移液器吸头，切开该吸头的窄端，形成一个足以让苍蝇通过它的开口。将此移液器吸头的底部插入试管的尾端;这将是吸气器的“飞端”，飞蝇将从这里被吸出（图 1C2）。
    4. 在管子的“飞端”插入一块网布或一层薄棉布 - 在管子和尖端之间的连接处。确保吸入移液器吸头的苍蝇仍然被困在吸头中，位于网片前面。
    5. 使用封口膜密封管道和移液器吸头之间的连接处。
  3. 制备单壳管和成套样品瓶
    1. 单壳管的制备
      1. 将近 500 μL 新鲜制备的苍蝇食物添加到 2 mL 微量离心管中（图 1D）。使用微型离心机将食物拉到管子的底部。
      2. 将盖子打开过夜，使食物在室温下凝固。用一块细布盖住管子，以防止流浪的苍蝇进入管子。
      3. 用针头在微量离心管的盖子上穿孔，使空气流通，待食物凝固后盖上盖子。
    2. 制备组壳样品瓶
      1. 取普通的苍蝇小瓶，并在小瓶中装满新鲜制备的食物（图 1D）。
  4. 在实验前准备果蝇
    1. 在25°C的培养箱中，在25°C的培养箱中，在12小时的光照/黑暗循环中，将所需基因型的苍蝇系保持在含有标准果蝇食物的常规玻璃/塑料瓶中。
    2. 收集所需基因型的新封闭（0 至 24 小时）果蝇，并使用立体显微镜在二氧化碳麻醉下对它们进行性别分离。
    3. 将一半的雄性果蝇单独插入“单壳管”中。将另一半雄性果蝇以 10 只为一组，雌性果蝇放在常规的“群养小瓶”中，创造一种社会条件。将所有试管和样品瓶在 25 °C 下储存 5 天。
      注意：在行为室中保持 24-25 °C 的温度和 ~50% 的湿度。使用的果蝇品系为：w1118 和 FMR 反式杂合突变果蝇 （Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M）57。隔离 5 天的 Fmr1 果蝇对另一只雄性的攻击性明显减少（图 1E）。
  5. 执行攻击行为实验
    1. 在 ZT0-ZT3 时间窗口内进行攻击性实验，因为果蝇在一天中的这个时间显示出峰值活动。
      注意：ZT=标准 12 小时光照/黑暗循环中的 Zeitgeber 时间;ZT0= 亮灯，即光相开始，ZT3= 光相开始后 3 h，以此类推。ZT12 = 熄灯。
    2. 通过口抽吸法将两只雄性果蝇从单饲室或群养室通过盖子上的孔转移到侵略性领域;立即将洞移开，以确保苍蝇无法逃脱。
    3. 让苍蝇在竞技场内适应 1-2 分钟。启动计时器 20 分钟。通过使用支架将相机或手机完全垂直放置在竞技场上方，对整个 20 分钟的苍蝇进行视频记录。确保在视频中可以看到激进的较量类型。
      注意：确保场馆的照明清晰，并避免盖子的任何眩光/反射直接落在相机镜头上。
    4. 对每种基因型和每种类型的住房条件的 15-20 对果蝇重复实验。
      注意：无意识偏差可以通过对照和测试果蝇以及属于多种基因型的视频文件的双重盲法来消除。
  6. 分析攻击性分析数据
    1. 将视频文件传输到具有足够大屏幕的计算机，以便可以看到咄咄逼人的较量。
    2. 播放视频并计算 20 分钟58,59 时间内激进比赛的总数。
    3. 在电子表格中编译和组织来自每种基因型和每种外壳模式的数据，并使用任何统计软件进行数据分析。执行双尾 t 检验并将数据绘制为盒须。

2. 社交空间检测

注意：此处描述的测定方案、竞技场和分析已在前面60,61 中描述。

  1. 准备社交空间分析 （SSA） 舞台
    1. 将两个三角形丙烯酸垫片（高度 = 8.9 厘米，底座 = 6.7 厘米，厚度 = 0.3 厘米）平放在矩形玻璃板（13.5 厘米 x 10.4 厘米，厚度 0.3 厘米）的顶部，使丙烯酸垫片的直角与玻璃板的角对齐（图 2A）。
    2. 将两个矩形亚克力垫片（6.7 厘米 x 1.5 厘米，厚度 = 0.3 厘米）平放在玻璃板上，与两个三角形垫片的底座对齐。完成此安排后，确认四个丙烯酸垫片围绕着矩形玻璃板上的三角形竞技场（~2.16 平方厘米61），该玻璃板未被垫片覆盖（图 2A、B）。将尺子的贴纸（图 2C）放在其中一个三角形垫片上，并确保从顶部可以看到它。
    3. 现在将第二块矩形玻璃板（13.5 厘米 x 10.4 厘米，厚度 0.3 厘米）放在亚克力垫片的顶部，使其与底部的玻璃板对齐;亚克力垫片最终会夹在玻璃空间之间，在两块玻璃板之间的中间留下一个三角形空间。使用四个小活页夹固定窗格和垫片。
  2. 为 SSA 准备果蝇
    1. 收集所需基因型的新封闭（0 至 24 小时）果蝇，并使用立体显微镜在冷麻醉下将它们进行性别分离。
      注意：在 -20 °C 培养箱中冷却冷麻醉仪（可以使用培养皿）。将果蝇放入空小瓶中，将这些小瓶浸入冰中（在冰桶中），直到果蝇无法移动，将它们放在冷培养皿上，然后开始分拣。
    2. 将雄性和雌性果蝇分别存放在食品瓶中，在 25 °C 培养箱中以 12 小时的光照/黑暗循环保存 24 小时。
      注意：对于此处演示的实验，使用的果蝇品系是 w1118 和 FMR 反式杂合子突变果蝇 （Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M）。
  3. 执行 SSA 实验
    1. 保持与攻击性测定相同的实验条件（温度：24-25°C，湿度 ~ 50%）并在 ZT0-ZT3 时间窗口内进行实验。
    2. 取下右下角的活页夹，将矩形垫片稍微向外移动，以便在两个矩形垫片之间形成间隙 （~0.5 cm）。
    3. 将苍蝇（前一天收集的）从食品小瓶转移到空小瓶中。通过矩形垫片之间创造的空间轻轻吸气，将它们转移到社交空间领域（三角形区域）。立即将矩形垫片和活页夹滑回原位，关闭空间，确保没有空间让苍蝇逃脱。
    4. 通过将腔室保持在直立位置，将腔室轻轻敲打到软垫上 3 次，以确保在实验开始时所有果蝇都在腔室的底部。
    5. 将 SSA 腔室夹在直立位置并启动计时器。20 分钟后，当苍蝇在竞技场中的位置停留并显示出最小的移动时，拍摄一张清晰的竞技场照片。避免眩光和不规则的照明。
    6. 通过捣打苍蝇并重复步骤 2.3.5 至 2.3.7 的步骤（内部重复），对相同的苍蝇种群重复实验 3 次。用相同基因型/条件的不同果蝇种群重复 3 次（独立重复）。
      注：冷冻检测室以丢弃检测室中的果蝇。用乙醇擦拭玻璃和塑料表面，以去除所有气味，在对一组果蝇进行一轮实验后。
  4. 分析社交空间分析数据
    1. 在 ImageJ62 软件中分析图像并列出如前所述61 的苍蝇间最近邻距离。
    2. 使用统计软件执行统计分析并绘制图表。
      注：此处描述的用于 SSA 测定的果蝇菌株是 w1118 和 Fmr1 反杂合突变果蝇 （Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M）57。 Fmr1 苍蝇与最近邻居的距离显着增加（图 2D）。

3. 求偶试验

  1. 求爱室
    1. 按照图 3B 所示的顺序将求偶室的所有四个部分（图 3A）组装在一起。夹在盖子和基片之间的中央圆盘的每个穿孔将用作“求偶室”（图 3C）。
  2. 获得预配雌性
    1. 启动并维持多个 CS（Canton S，野生型）果蝇培养瓶，每个食品瓶中有 ~60-100 只雄性和雌性果蝇。
    2. 当成虫出现时，丢弃所有成蝇，每 2-3 小时将从这些瓶子中出现的苍蝇转移到补充有少量酵母糊的新食品瓶中。
      注：避免样品瓶过度拥挤。小心不要将老苍蝇、幼虫或蛹转移到交配的小瓶中。
    3. 将这些“交配瓶”孵育 4 天，以确保所有雌性都已交配。
  3. 阳螺纹单壳管的制备
    1. 向每个 2 mL 微量离心管中加入近 500 μL 果蝇食物。使用微型离心机将食物拉到管子的底部。
    2. 让食物过夜凝固，切开微量离心管的盖子，用封口膜覆盖，然后用针头在封口膜上穿孔，使空气流通。
  4. 收集和分离处女雄性
    1. 在单独的食品小瓶中与所需基因型的 10-15 只雄性和 20-30 只处女雌性建立杂交。
    2. 从后代中收集所需基因型的处女雄性，并使用抽吸器将它们单独保存在“单壳管”中。每 5-6 小时继续收集新封闭的雄性（每种基因型最多 40-50 只雄性），并将它们分离在单个单壳管中。
    3. 用封口膜重新密封管盖。
  5. 进行求偶测定实验
    1. 测试雄性隔离 5 天后，在 ZT0-ZT3 时间窗口内进行求偶测定。
    2. 提前设置好视频记录设备，重点放在分析工作区。
    3. 在吸气器的帮助下，从交配瓶中收集一只预先交配的雌性（6-10 天大）并插入求偶室。
    4. 使用抽吸器，通过转移孔轻轻地将雄性（对照/测试）苍蝇从单壳管转移到包含单个预配对雌性的求偶室。快速旋转盖子以关闭腔室。
    5. 视频记录苍蝇的行为 15 分钟。
  6. 视频数据分析与统计
    1. 将视频文件传输到计算机;通过手动浏览视频，记录雄性在 15 分钟内求偶所花费的时间。
    2. 计算每只雄性苍蝇的求偶指数 （CI），即雄性在 15 分钟内向雌性求爱所花费的时间的分数（或百分比）。
    3. 计算 15 分钟内交 配尝试 的总数。
    4. 请注意雄性在第一次尝试求爱之前显示的时滞持续时间，称为求偶潜伏期 （CL）。
      注意：建议分析每种条件/基因型 40-60 名男性，以获得统计功效并确定 CI 结果的一致性。

4. 梳理行为测定

  1. 梳理行为检测领域
    1. 使用体积为 ~0.4 cm3 的小圆形腔室作为记录梳理行为的舞台。
      注意：第 3 节中描述的相同求偶舞台可用于梳理行为测定。
    2. 由于梳理行为涉及记录腿部等较精细器官的运动，因此请使用高分辨率或高对比度的视频记录。要遵循此协议，请使用漫射玻璃覆盖的 LED 面板作为尺寸为 20 cm x 20 cm 的均匀照明表面。将求偶室放在面板顶部，以确保光线从底部穿过求偶室。
  2. 在实验前准备果蝇
    1. 将食品瓶中的实验基因型果蝇保持在 25 °C 和 12 小时的光照/黑暗循环。
    2. 收集所需基因型的新封闭（0 至 24 小时）果蝇，并使用立体显微镜在冷麻醉下将它们进行性别分离，如社交空间测定中所述。
    3. 将雄性果蝇隔离在单壳管中（用于攻击性测定）24 小时。
      注：对于此处演示的实验，使用的果蝇品系为： W1118 和 FMR 反杂合突变果蝇 （Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M）。
  3. 进行梳理行为分析
    1. 保持温度 24-25 °C 和湿度 ~ 50%;在 ZT0-ZT3 时间窗16 期间进行实验。
    2. 使用吸气器将单舍雄性苍蝇从单壳管转移到梳理领域。立即滑开盖子上的孔，确保苍蝇无法逃脱。
    3. 将梳理竞技场放在漫射的 LED 面板上，让苍蝇在竞技场内适应 1 分钟。通过将摄像机完全垂直放置在安装在支架上的竞技场上方，视频录制飞行 10 分钟。确保诱骗回合的类型在视频中可见且可量化。
      注意：梳理行为包括用腿摩擦头部、眼睛、触角、长鼻胸部、腹部、生殖器和翅膀（第一对：T1，第二对：T2，或第三对腿：T3）。本研究中考虑的梳理行为参数如 Andrew 等人 41 所述，并在 图 4 中演示。
    4. 对每种基因型重复实验。
    5. 分析梳理行为数据
      1. 分析视频并计算以下四个参数： 美容指数 （美容时间的百分比）; 修饰潜伏期 （距离第一次修饰比赛的时间）; 梳理回合数;和 平均梳理比赛持续时间 （总比赛持续时间/比赛次数）。
      2. 当一只苍蝇停止显示任何参数并保持不动 2 秒或停止比赛并走至少 4 步时，将一次梳理比赛标记为结束。

5. 嗅觉习惯化检测

注意：如图 5 所示，最终组装需要在 Y 迷宫测定54,56 当天完成。

  1. 为苍蝇的适应做准备
    1. 在环境温度为 25 °C、湿度为 70% 的标准 12 小时光照下，在培养箱中培养所有实验所需基因型的果蝇：12 小时暗循环 （LD）。
    2. 收集 0-12 小时龄、新封闭的果蝇，并将 ~30-40 只果蝇转移到带有拧紧棉塞的新鲜培养基瓶中。
    3. 为每个瓶子分配代码，以使实验者对实验中的基因型不知情。
  2. 嗅觉习惯化的诱导
    1. 将 1 mL 用石蜡液（轻）稀释的首选气味剂放入 1.5 mL 微量离心管中。对于对照，只需在 1.5 mL 微量离心管中使用 1 mL 石蜡液光。将管中的内容物涡旋 10 分钟以确保均匀混合，然后用均匀穿孔的保鲜膜覆盖。
      注意：在视频中，将使用 20% 的丁酸乙酯。
    2. 使用金属丝将含有稀释气味剂的试管或仅稀释剂液体悬浮在装有果蝇的单独培养基瓶中。
    3. 用棉花盖好瓶子，然后用牛皮纸包裹，以防止气味蒸气扩散。将对照瓶和含气味的瓶子分别标记为 naïve 和 odor-exposed （habituated）。将这些诱导瓶在具有上述条件的培养箱中放置 3 天。
  3. 苍蝇和 Y 迷宫装置的制备
    1. 将果蝇从诱导瓶转移到仅装有浸水滤纸的小瓶中。
    2. 在实验前，在室温下将它们饿死约 16-18 小时以增加动力。
    3. 确保 Y 迷宫装置的组件清洁无异味;以垂直方式组装四个部分。将攀爬室连接到 Y 型迷宫，然后将其连接到适配器的顶部。将 Y 迷宫的底部牢固地连接到用作底部中央杆的入口小瓶上，如图 5 所示。
    4. 使用无异味硅胶管将每个攀爬室的锥形端与含有加臭剂（用蒸馏水稀释 10-3 稀释）的试剂瓶连接。
    5. 在真空泵的帮助下，以相等的流速 （~120 mL/min） 将加臭剂从气瓶泵送到 Y 的两个臂，并使其饱和 15 分钟以保持一致性。
  4. 进行经典的 Y 迷宫测定
    1. 轻轻地将每个小瓶中饥饿的苍蝇引入 Y 迷宫设置的入口小瓶中。
    2. 让他们短暂适应;将入口样品瓶与 Y 迷宫适配器连接以开始测试;让苍蝇爬上 Y 迷宫臂并被困在两个收集室中。将每个测试的持续时间设置为 1 分钟。
    3. 完成后，将苍蝇轻敲到入口小瓶的底部，并切换 Y 迷宫臂的位置以避免侧面偏倚。对同一组果蝇进行四次读数。
    4. 记录在持续时间内攀爬 Y 迷宫的两个臂中每个臂的苍蝇数量。
    5. 重复测定至少 8 个批次以获得代表性数据集。
  5. 分析和解释收集的数据
    1. 通过计算 性能指数 （PI） 来量化结果，该指数可以表示为选择空气臂 （A） 的果蝇数量与选择气味臂 （O） 的苍蝇数量之间的差值，作为参与者苍蝇总数的分数。
    2. 使用统计检验 （未配对的学生 t 检验） 来检查幼稚与气味暴露的果蝇的 PI 是否显著。

结果

侵略性试验
作为果蝇 ASD 模型，Fmr1 突变果蝇已被使用63,64。w1118 只雄性用作对照，Fmr1 反式杂合子 Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 只雄性果蝇作为实验果蝇;成年雄性被安置在隔离管中 5 天。将同型雄性 （相同的基因型，相同的住房条件） 引入攻击性领域，并记录它们的行为 20 分钟。计算每种基因...

讨论

果蝇 被用作人类神经系统疾病研究的精细模式生物，因为果蝇和人类疾病基因之间的基因序列高度保守9。许多稳健的行为范式使其成为研究在概括人类疾病的突变体中表现出的表型的有吸引力的模型。由于数百个基因与自闭症谱系障碍 （ASD） 有关，因此任何模式生物中都不存在常见的 ASD 模型。因此，对于每个突变体，研究人员必须首先在果蝇中建立 ASD 样表型。在本?...

披露声明

作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

我们非常感谢 Mani Ramaswami（NCBS，班加罗尔）和 Baskar Bakthavachalu（IIT Mandi）的习惯和气味选择测定设置，Pavan Agrawal （MAHE） 对攻击性测定的宝贵建议，Amitava Majumdar（NCCS，浦那）分享他的求偶测定室原型和 Fmr1 突变飞行系，以及 Gaurav Das（NCCS，浦那）分享 MB247-GAL4 系。我们感谢布卢明顿 果蝇 种群中心（BDSC，美国印第安纳州）、国家遗传学研究所（NIG，日本京都）、巴纳拉斯印度教大学（BHU，印度瓦拉纳西）和国家生物科学中心（NCBS，印度班加罗尔）的 果蝇 品系。实验室的工作得到了 SERB-DST （ECR/2017/002963） 对 AD 的赠款、授予 AD 的 DBT Ramalingaswami 奖学金 （BT/RLF/Re-entry/11/2016） 以及印度 IIT Kharagpur 的机构支持。SD 和 SM 获得 CSIR-Senior Research Fellowship 的博士奖学金;PM 获得印度 MHRD 的博士学位。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheetAlternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizesThickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapesi) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambersx2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vialPerspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottlesBorosil #1500017
Gas washing stopperBorosil #1761021
Glass vialOD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) lightSRL #18211
Roller clampsPolymed #14098
Silicone tubesOD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pumpHana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-mazeBorosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottlesOD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vialsOD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism softwarehttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ softwarehttps://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set upCamcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
CottonAbsorbent, autoclaved
ParafilmSigma-aldrich #P7793
Pipette tips200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tubelength= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNABDSC # 25971

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