Imaging dal vivo per quantificare la radiosensibilità cellulare negli organoidi tumorali derivati da pazienti

Summary

Qui, descriviamo in dettaglio un semplice approccio di imaging dal vivo per quantificare la sensibilità degli organoidi tumorali derivati da pazienti alle radiazioni ionizzanti.

Abstract

La radioterapia (RT) è uno dei pilastri della moderna gestione clinica del cancro. Tuttavia, non tutti i tipi di cancro sono ugualmente sensibili all'irradiazione, spesso (ma non sempre) a causa delle differenze nella capacità delle cellule maligne di riparare il danno ossidativo al DNA provocato dai raggi ionizzanti. I saggi clonogenici sono stati impiegati per decenni per valutare la sensibilità delle cellule tumorali in coltura alle radiazioni ionizzanti, in gran parte perché le cellule tumorali irradiate spesso muoiono in modo ritardato che è difficile da quantificare con tecniche di citometria a flusso a breve termine o tecniche assistite da microscopia. Sfortunatamente, i saggi clonogenici non possono essere impiegati come tali per modelli tumorali più complessi, come gli organoidi tumorali derivati da pazienti (PDTO). Infatti, l'irradiazione di PDTO stabiliti potrebbe non necessariamente abrogare la loro crescita come unità multicellulari, a meno che il loro compartimento simile a uno stelo non sia completamente sradicato. Inoltre, l'irradiazione di sospensioni di singole cellule derivate da PDTO potrebbe non ricapitolare correttamente la sensibilità delle cellule maligne alla RT nel contesto di PDTO stabiliti. Qui, descriviamo in dettaglio un adattamento dei saggi clonogenici convenzionali che prevede l'esposizione di PDTO stabiliti a radiazioni ionizzanti, seguita da dissociazione di singole cellule, replating in condizioni di coltura adeguate e imaging dal vivo. Le cellule staminali non irradiate (di controllo) derivate da PDTO riformano i PDTO in crescita con un'efficienza PDTO-specifica, che è influenzata negativamente dall'irradiazione in modo dose-dipendente. In queste condizioni, l'efficienza e il tasso di crescita della PDTO possono essere quantificati come misura della radiosensibilità su immagini time-lapse raccolte fino a quando i PDTO di controllo non raggiungono un'occupazione di spazio predefinita.

Introduction

La radioterapia a fasci esterni (RT) è uno dei pilastri dell'oncologia moderna, che riflette non solo una pronunciata attività antitumorale associata a uno spettro ben definito di effetti collaterali generalmente gestibili¹, ma anche una disponibilità clinica eccezionalmente diffusa (la maggior parte dei centri oncologici nei paesi sviluppati è dotata di moderni acceleratori lineari per RT a fascio esterno)². In linea con questa nozione, la RT è impiegata con successo a livello globale sia per scopi curativi, generalmente nel contesto della malattia in stadio iniziale

Protocol

I reagenti e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Coltura di organoidi

NOTA: I PDTO TNBC#1 sono stati stabiliti nel nostro laboratorio sulla base di tessuto tumorale rimosso chirurgicamente da una paziente con carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) che ha fornito il consenso informato a partecipare a un protocollo di biobanca (IRB21-06023682). Dopo l.......

Discussion

Qui, descriviamo un adattamento di saggi clonogenici convenzionali che sfrutta i PDTO del cancro al seno e l'imaging dal vivo per quantificare la radiosensibilità al PDTO in base a (1) la persistenza di cellule staminali che formano PTDO dopo l'irradiazione PDTO in vitro e (2) il tasso di crescita dei PDTO che queste cellule (possono) generare. Le fasi critiche di questo protocollo includono (1) l'istituzione di PDTO per l'occupazione di una cupola che consenta una buona vitali.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen	35050061
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte software 2021A	Sartorius		version: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		model SX1
Incucyte validated 48 well plate	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypan blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049