Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Qui, descriviamo in dettaglio un semplice approccio di imaging dal vivo per quantificare la sensibilità degli organoidi tumorali derivati da pazienti alle radiazioni ionizzanti.

Abstract

La radioterapia (RT) è uno dei pilastri della moderna gestione clinica del cancro. Tuttavia, non tutti i tipi di cancro sono ugualmente sensibili all'irradiazione, spesso (ma non sempre) a causa delle differenze nella capacità delle cellule maligne di riparare il danno ossidativo al DNA provocato dai raggi ionizzanti. I saggi clonogenici sono stati impiegati per decenni per valutare la sensibilità delle cellule tumorali in coltura alle radiazioni ionizzanti, in gran parte perché le cellule tumorali irradiate spesso muoiono in modo ritardato che è difficile da quantificare con tecniche di citometria a flusso a breve termine o tecniche assistite da microscopia. Sfortunatamente, i saggi clonogenici non possono essere impiegati come tali per modelli tumorali più complessi, come gli organoidi tumorali derivati da pazienti (PDTO). Infatti, l'irradiazione di PDTO stabiliti potrebbe non necessariamente abrogare la loro crescita come unità multicellulari, a meno che il loro compartimento simile a uno stelo non sia completamente sradicato. Inoltre, l'irradiazione di sospensioni di singole cellule derivate da PDTO potrebbe non ricapitolare correttamente la sensibilità delle cellule maligne alla RT nel contesto di PDTO stabiliti. Qui, descriviamo in dettaglio un adattamento dei saggi clonogenici convenzionali che prevede l'esposizione di PDTO stabiliti a radiazioni ionizzanti, seguita da dissociazione di singole cellule, replating in condizioni di coltura adeguate e imaging dal vivo. Le cellule staminali non irradiate (di controllo) derivate da PDTO riformano i PDTO in crescita con un'efficienza PDTO-specifica, che è influenzata negativamente dall'irradiazione in modo dose-dipendente. In queste condizioni, l'efficienza e il tasso di crescita della PDTO possono essere quantificati come misura della radiosensibilità su immagini time-lapse raccolte fino a quando i PDTO di controllo non raggiungono un'occupazione di spazio predefinita.

Introduction

La radioterapia a fasci esterni (RT) è uno dei pilastri dell'oncologia moderna, che riflette non solo una pronunciata attività antitumorale associata a uno spettro ben definito di effetti collaterali generalmente gestibili1, ma anche una disponibilità clinica eccezionalmente diffusa (la maggior parte dei centri oncologici nei paesi sviluppati è dotata di moderni acceleratori lineari per RT a fascio esterno)2. In linea con questa nozione, la RT è impiegata con successo a livello globale sia per scopi curativi, generalmente nel contesto della malattia in stadio iniziale

Protocol

I reagenti e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Coltura di organoidi

NOTA: I PDTO TNBC#1 sono stati stabiliti nel nostro laboratorio sulla base di tessuto tumorale rimosso chirurgicamente da una paziente con carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) che ha fornito il consenso informato a partecipare a un protocollo di biobanca (IRB21-06023682). Dopo l.......

Representative Results

I PDTO TNBC#1 sono stati esposti a una singola dose di radiazioni di 0 (controlli non irradiati), 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy o 10 Gy il giorno 0. Subito dopo, i PDTO sono stati dissociati per ottenere una sospensione a singola cellula per ogni condizione sperimentale. Le cellule derivate da PDTO sono state successivamente seminate in piastre da 48 pozzetti all'interno del 66% di cupole matrigel (50 μL ciascuna) depositate al centro dei pozzetti, in 3 repliche tecniche per condizione. Le pia.......

Discussion

Qui, descriviamo un adattamento di saggi clonogenici convenzionali che sfrutta i PDTO del cancro al seno e l'imaging dal vivo per quantificare la radiosensibilità al PDTO in base a (1) la persistenza di cellule staminali che formano PTDO dopo l'irradiazione PDTO in vitro e (2) il tasso di crescita dei PDTO che queste cellule (possono) generare. Le fasi critiche di questo protocollo includono (1) l'istituzione di PDTO per l'occupazione di una cupola che consenta una buona vitali.......

Acknowledgements

Ringraziamo Raymond Briones e Wen H. Shen (Weill Cornell Medical College, New York, NY, USA) per il loro aiuto nello sviluppo di questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Transformative Breast Cancer Consortium del DoD BCRP degli Stati Uniti (#W81XWH2120034, PI: Formenti).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
40 µm mesh filterThomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell CounterNexcelom
DMEM F/12Corning 12634-010
Epidermal Growth Factor hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 35050061
HepesInvitrogen 15630-080
IncuCyte software 2021ASartoriusversion: 2021A
Incucyte SX1Sartoriusmodel SX1
Incucyte validated 48 well plateCorning 3548
MatrigelDiscovery Labware354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginPurchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plateCellstar657 185
NR (Heregulin)Peprotech100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBSCorning 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin MediaPurchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP) Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01Tocris2939
Trypan blue Stain (0.4%)Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 (RhoKi)SelleckS1049

References

  1. De Ruysscher, D., et al. Radiotherapy toxicity. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 13 (2019).
  2. Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for ....

Explore More Articles

Parole chiave Live ImagingRadiosensibilit cellulareOrganoidi tumorali derivati da pazientiRadioterapiaSaggi clonogeniciDanno al DNACellule staminaliEfficienza di formazione di PDTOTasso di crescita

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved