Imagens ao vivo para quantificar a radiossensibilidade celular em organoides tumorais derivados de pacientes

Summary

Aqui, detalhamos uma abordagem direta de imagem ao vivo para quantificar a sensibilidade dos organoides tumorais derivados do paciente à radiação ionizante.

Abstract

A radioterapia (RT) é um dos pilares do tratamento clínico moderno do câncer. No entanto, nem todos os tipos de câncer são igualmente sensíveis à irradiação, muitas vezes (mas nem sempre) devido às diferenças na capacidade das células malignas de reparar danos oxidativos ao DNA provocados por raios ionizantes. Os ensaios clonogênicos têm sido empregados há décadas para avaliar a sensibilidade das células cancerígenas cultivadas à irradiação ionizante, principalmente porque as células cancerígenas irradiadas geralmente morrem de maneira tardia que é difícil de quantificar com técnicas assistidas por citometria de fluxo ou microscopia de curto prazo. Infelizmente, os ensaios clonogênicos não podem ser empregados como tal para modelos tumorais mais complexos, como organoides tumorais derivados de pacientes (PDTOs). De fato, a irradiação de PDTOs estabelecidos pode não necessariamente anular seu crescimento como unidades multicelulares, a menos que seu compartimento semelhante a um tronco seja completamente erradicado. Além disso, a irradiação de suspensões unicelulares derivadas de PDTO pode não recapitular adequadamente a sensibilidade das células malignas à RT no contexto de PDTOs estabelecidos. Aqui, detalhamos uma adaptação de ensaios clonogênicos convencionais que envolve a exposição de PDTOs estabelecidos à radiação ionizante, seguida de dissociação de célula única, replaqueamento em condições de cultura adequadas e imagens ao vivo. As células-tronco derivadas de PDTO não irradiadas (controle) reformam PDTOs em crescimento com uma eficiência específica de PDTO, que é influenciada negativamente pela irradiação de maneira dose-dependente. Nessas condições, a eficiência de formação de PDTO e a taxa de crescimento podem ser quantificadas como uma medida de radiossensibilidade em imagens de lapso de tempo coletadas até que as PDTOs de controle atinjam uma ocupação de espaço predefinida.

Introduction

A radioterapia de feixe externo (RT) é um dos pilares da oncologia moderna, refletindo não apenas uma atividade anticancerígena pronunciada associada a um espectro bem definido de efeitos colaterais geralmente gerenciáveis¹, mas também uma disponibilidade clínica excepcionalmente ampla (a maioria dos centros de câncer nos países desenvolvidos está equipada com aceleradores lineares modernos para RT de feixe externo)². Em consonância com essa noção, a RT é globalmente empregada com sucesso tanto para fins curativos, geralmente no contexto da doença em estágio inicial

Protocol

Os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura organoide

NOTA: Os PDTOs TNBC#1 foram estabelecidos em nosso laboratório com base em tecido tumoral removido cirurgicamente de uma paciente com câncer de mama triplo-negativo (TNBC) que forneceu consentimento informado para participar de um protocolo de biobanco (IRB21-06023682). Após validação por.......

Discussion

Aqui, descrevemos uma adaptação de ensaios clonogênicos convencionais que aproveita PDTOs de câncer de mama e imagens ao vivo para quantificar a radiossensibilidade do PDTO com base em (1) a persistência de células-tronco formadoras de PTDO após a irradiação de PDTO in vitro e (2) a taxa de crescimento dos PDTOs que essas células (podem) gerar. As etapas críticas deste protocolo incluem (1) o estabelecimento de PDTOs para uma ocupação de cúpula que permita boa viab.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen	35050061
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte software 2021A	Sartorius		version: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		model SX1
Incucyte validated 48 well plate	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypan blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049