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* These authors contributed equally
Aqui, detalhamos uma abordagem direta de imagem ao vivo para quantificar a sensibilidade dos organoides tumorais derivados do paciente à radiação ionizante.
A radioterapia (RT) é um dos pilares do tratamento clínico moderno do câncer. No entanto, nem todos os tipos de câncer são igualmente sensíveis à irradiação, muitas vezes (mas nem sempre) devido às diferenças na capacidade das células malignas de reparar danos oxidativos ao DNA provocados por raios ionizantes. Os ensaios clonogênicos têm sido empregados há décadas para avaliar a sensibilidade das células cancerígenas cultivadas à irradiação ionizante, principalmente porque as células cancerígenas irradiadas geralmente morrem de maneira tardia que é difícil de quantificar com técnicas assistidas por citometria de fluxo ou microscopia de curto prazo. Infelizmente, os ensaios clonogênicos não podem ser empregados como tal para modelos tumorais mais complexos, como organoides tumorais derivados de pacientes (PDTOs). De fato, a irradiação de PDTOs estabelecidos pode não necessariamente anular seu crescimento como unidades multicelulares, a menos que seu compartimento semelhante a um tronco seja completamente erradicado. Além disso, a irradiação de suspensões unicelulares derivadas de PDTO pode não recapitular adequadamente a sensibilidade das células malignas à RT no contexto de PDTOs estabelecidos. Aqui, detalhamos uma adaptação de ensaios clonogênicos convencionais que envolve a exposição de PDTOs estabelecidos à radiação ionizante, seguida de dissociação de célula única, replaqueamento em condições de cultura adequadas e imagens ao vivo. As células-tronco derivadas de PDTO não irradiadas (controle) reformam PDTOs em crescimento com uma eficiência específica de PDTO, que é influenciada negativamente pela irradiação de maneira dose-dependente. Nessas condições, a eficiência de formação de PDTO e a taxa de crescimento podem ser quantificadas como uma medida de radiossensibilidade em imagens de lapso de tempo coletadas até que as PDTOs de controle atinjam uma ocupação de espaço predefinida.
A radioterapia de feixe externo (RT) é um dos pilares da oncologia moderna, refletindo não apenas uma atividade anticancerígena pronunciada associada a um espectro bem definido de efeitos colaterais geralmente gerenciáveis1, mas também uma disponibilidade clínica excepcionalmente ampla (a maioria dos centros de câncer nos países desenvolvidos está equipada com aceleradores lineares modernos para RT de feixe externo)2. Em consonância com essa noção, a RT é globalmente empregada com sucesso tanto para fins curativos, geralmente no contexto da doença em estágio inicial
Os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Cultura organoide
NOTA: Os PDTOs TNBC#1 foram estabelecidos em nosso laboratório com base em tecido tumoral removido cirurgicamente de uma paciente com câncer de mama triplo-negativo (TNBC) que forneceu consentimento informado para participar de um protocolo de biobanco (IRB21-06023682). Após validação por.......
Os PDTOs TNBC#1 foram expostos a uma dose única de radiação de 0 (controles não irradiados), 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy ou 10 Gy no dia 0. Imediatamente após, os PDTOs foram dissociados para obter uma suspensão unicelular para cada condição experimental. As células derivadas de PDTO foram semeadas em placas de 48 poços dentro de cúpulas de matrigel de 66% (50 μL cada) depositadas no centro dos poços, em 3 repetições técnicas por condição. As placas foram colocadas em um sis.......
Aqui, descrevemos uma adaptação de ensaios clonogênicos convencionais que aproveita PDTOs de câncer de mama e imagens ao vivo para quantificar a radiossensibilidade do PDTO com base em (1) a persistência de células-tronco formadoras de PTDO após a irradiação de PDTO in vitro e (2) a taxa de crescimento dos PDTOs que essas células (podem) gerar. As etapas críticas deste protocolo incluem (1) o estabelecimento de PDTOs para uma ocupação de cúpula que permita boa viab.......
Agradecemos a Raymond Briones e Wen H. Shen (Weill Cornell Medical College, Nova York, NY, EUA) por sua ajuda no desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi apoiado por uma Concessão Transformativa do Consórcio de Câncer de Mama do US DoD BCRP (#W81XWH2120034, PI: Formenti).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
40 µm mesh filter | Thomas Scientific | 1164H35 | |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter | Nexcelom | ||
DMEM F/12 | Corning | 12634-010 | |
Epidermal Growth Factor hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope | Thermo Fisher Scientific | 12-563-460 | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
FGF7 | Peprotech | 100-19 | |
GlutaMax | Invitrogen | 35050061 | |
Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
IncuCyte software 2021A | Sartorius | version: 2021A | |
Incucyte SX1 | Sartorius | model SX1 | |
Incucyte validated 48 well plate | Corning | 3548 | |
Matrigel | Discovery Labware | 354230 | |
nAc | Sigma Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA | ||
Non-treated 6 well plate | Cellstar | 657 185 | |
NR (Heregulin) | Peprotech | 100-03 | |
p38 MAP inhibitor p38i SB202190 | Sigma Aldrich | S7067 | |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | |
Rspondin Media | Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA | ||
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP) | Xstrahl Ltd | ||
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01 | Tocris | 2939 | |
Trypan blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-61 | |
TrypLE | Gibco | 112605-028 | |
Y-27632 (RhoKi) | Selleck | S1049 |
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