Визуализация в реальном времени для количественной оценки клеточной радиочувствительности в опухолевых органоидах, полученных от пациента

Summary

В этой статье мы подробно описываем простой подход к визуализации в реальном времени для количественной оценки чувствительности опухолевых органоидов пациента к ионизирующему излучению.

Abstract

Лучевая терапия (ЛТ) является одним из основных элементов современного клинического лечения рака. Тем не менее, не все типы рака одинаково чувствительны к облучению, часто (но не всегда) из-за различий в способности злокачественных клеток восстанавливать окислительные повреждения ДНК, вызванные ионизирующими лучами. Клоногенные анализы использовались на протяжении десятилетий для оценки чувствительности культивируемых раковых клеток к ионизирующему облучению, в основном потому, что облученные раковые клетки часто умирают с задержкой, которую трудно количественно оценить с помощью методов краткосрочной проточной цитометрии или микроскопии. К сожалению, клоногенные анализы не могут быть использованы как таковые для более сложных моделей опухолей, таких как опухолевые органоиды (PDTO), полученные от пациента. Действительно, облучение укоренившихся PDTO не обязательно может привести к прекращению их роста как многоклеточных единиц, если их стеблевидный компартмент не будет полностью уничтожен. Кроме того, облучение суспензий одиночных клеток, полученных из PDTO, может не отражать должным образом чувствительность злокачественных клеток к ОТ в контексте установленных PDTO. В данной статье мы подробно описываем адаптацию традиционных клоногенных анализов, которая включает в себя воздействие ионизирующего излучения на устоявшиеся PDTO с последующей диссоциацией одиночных клеток, повторным покрытием в подходящих условиях культивирования и визуализацией в реальном времени. Необлученные (контрольные) стволовые клетки, полученные из PDTO, реформируют растущие PDTO с PDTO-специфической эффективностью, на которую отрицательно влияет облучение дозозависимым образом. В этих условиях эффективность и скорость роста PDTO могут быть количественно оценены как мера радиочувствительности на покадровых изображениях, собранных до тех пор, пока контрольные PDTO не достигнут заданного пространства заполнения.

Introduction

Дистанционная лучевая терапия (ЛТ) является одним из столпов современной онкологии, отражая не только выраженную противоопухолевую активность^{, связанную} с четко определенным спектром в целом управляемых побочных эффектов1, но и исключительно широкую клиническую доступность (большинство онкологических центров в развитых странах оснащены современными линейными ускорителями для дистанционной лучевой лучевой терапии)². В соответствии с этим представлением, ЛТ успешно применяется во всем мире как в целях лечения, как правило, в контексте ранних стадий ^{заболевания3....}

Protocol

Реагенты и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Органоидная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: TNBC#1 PDTO были созданы в нашей лаборатории на основе опухолевой ткани, удаленной хирургическим п.......

Discussion

В данной работе мы описываем адаптацию традиционных клоногенных анализов, которая использует PDTO рака молочной железы и визуализацию в реальном времени для количественной оценки радиочувствительности PDTO на основе (1) стойкости PTDO-образующих стволовых клеток при облу.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen	35050061
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte software 2021A	Sartorius		version: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		model SX1
Incucyte validated 48 well plate	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypan blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049