Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этой статье мы подробно описываем простой подход к визуализации в реальном времени для количественной оценки чувствительности опухолевых органоидов пациента к ионизирующему излучению.

Abstract

Лучевая терапия (ЛТ) является одним из основных элементов современного клинического лечения рака. Тем не менее, не все типы рака одинаково чувствительны к облучению, часто (но не всегда) из-за различий в способности злокачественных клеток восстанавливать окислительные повреждения ДНК, вызванные ионизирующими лучами. Клоногенные анализы использовались на протяжении десятилетий для оценки чувствительности культивируемых раковых клеток к ионизирующему облучению, в основном потому, что облученные раковые клетки часто умирают с задержкой, которую трудно количественно оценить с помощью методов краткосрочной проточной цитометрии или микроскопии. К сожалению, клоногенные анализы не могут быть использованы как таковые для более сложных моделей опухолей, таких как опухолевые органоиды (PDTO), полученные от пациента. Действительно, облучение укоренившихся PDTO не обязательно может привести к прекращению их роста как многоклеточных единиц, если их стеблевидный компартмент не будет полностью уничтожен. Кроме того, облучение суспензий одиночных клеток, полученных из PDTO, может не отражать должным образом чувствительность злокачественных клеток к ОТ в контексте установленных PDTO. В данной статье мы подробно описываем адаптацию традиционных клоногенных анализов, которая включает в себя воздействие ионизирующего излучения на устоявшиеся PDTO с последующей диссоциацией одиночных клеток, повторным покрытием в подходящих условиях культивирования и визуализацией в реальном времени. Необлученные (контрольные) стволовые клетки, полученные из PDTO, реформируют растущие PDTO с PDTO-специфической эффективностью, на которую отрицательно влияет облучение дозозависимым образом. В этих условиях эффективность и скорость роста PDTO могут быть количественно оценены как мера радиочувствительности на покадровых изображениях, собранных до тех пор, пока контрольные PDTO не достигнут заданного пространства заполнения.

Introduction

Дистанционная лучевая терапия (ЛТ) является одним из столпов современной онкологии, отражая не только выраженную противоопухолевую активность, связанную с четко определенным спектром в целом управляемых побочных эффектов1, но и исключительно широкую клиническую доступность (большинство онкологических центров в развитых странах оснащены современными линейными ускорителями для дистанционной лучевой лучевой терапии)2. В соответствии с этим представлением, ЛТ успешно применяется во всем мире как в целях лечения, как правило, в контексте ранних стадий заболевания3....

Protocol

Реагенты и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Органоидная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: TNBC#1 PDTO были созданы в нашей лаборатории на основе опухолевой ткани, удаленной хирургическим п.......

Representative Results

TNBC#1 PDTO подвергались воздействию однократной дозы облучения 0 (необлученный контроль), 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр или 10 Гр в день 0. Сразу после этого PDTO диссоциировали для получения одноклеточной суспензии для каждого экспериментального условия. Затем клетки, полученные из PDTO, б.......

Discussion

В данной работе мы описываем адаптацию традиционных клоногенных анализов, которая использует PDTO рака молочной железы и визуализацию в реальном времени для количественной оценки радиочувствительности PDTO на основе (1) стойкости PTDO-образующих стволовых клеток при облу.......

Acknowledgements

Мы благодарим Раймонда Брионеса и Вэнь Х. Шена (Weill Cornell Medical College, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США) за помощь в разработке данного протокола. Эта работа была поддержана грантом Консорциума по трансформационному раку молочной железы от BCRP Министерства обороны США (#W81XWH2120034, PI: Formenti).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
40 µm mesh filterThomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell CounterNexcelom
DMEM F/12Corning 12634-010
Epidermal Growth Factor hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 35050061
HepesInvitrogen 15630-080
IncuCyte software 2021ASartoriusversion: 2021A
Incucyte SX1Sartoriusmodel SX1
Incucyte validated 48 well plateCorning 3548
MatrigelDiscovery Labware354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginPurchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plateCellstar657 185
NR (Heregulin)Peprotech100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBSCorning 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin MediaPurchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP) Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01Tocris2939
Trypan blue Stain (0.4%)Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 (RhoKi)SelleckS1049

References

  1. De Ruysscher, D., et al. Radiotherapy toxicity. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 13 (2019).
  2. Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for ....

Explore More Articles

PDTO

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved