A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
В этой статье мы подробно описываем простой подход к визуализации в реальном времени для количественной оценки чувствительности опухолевых органоидов пациента к ионизирующему излучению.
Лучевая терапия (ЛТ) является одним из основных элементов современного клинического лечения рака. Тем не менее, не все типы рака одинаково чувствительны к облучению, часто (но не всегда) из-за различий в способности злокачественных клеток восстанавливать окислительные повреждения ДНК, вызванные ионизирующими лучами. Клоногенные анализы использовались на протяжении десятилетий для оценки чувствительности культивируемых раковых клеток к ионизирующему облучению, в основном потому, что облученные раковые клетки часто умирают с задержкой, которую трудно количественно оценить с помощью методов краткосрочной проточной цитометрии или микроскопии. К сожалению, клоногенные анализы не могут быть использованы как таковые для более сложных моделей опухолей, таких как опухолевые органоиды (PDTO), полученные от пациента. Действительно, облучение укоренившихся PDTO не обязательно может привести к прекращению их роста как многоклеточных единиц, если их стеблевидный компартмент не будет полностью уничтожен. Кроме того, облучение суспензий одиночных клеток, полученных из PDTO, может не отражать должным образом чувствительность злокачественных клеток к ОТ в контексте установленных PDTO. В данной статье мы подробно описываем адаптацию традиционных клоногенных анализов, которая включает в себя воздействие ионизирующего излучения на устоявшиеся PDTO с последующей диссоциацией одиночных клеток, повторным покрытием в подходящих условиях культивирования и визуализацией в реальном времени. Необлученные (контрольные) стволовые клетки, полученные из PDTO, реформируют растущие PDTO с PDTO-специфической эффективностью, на которую отрицательно влияет облучение дозозависимым образом. В этих условиях эффективность и скорость роста PDTO могут быть количественно оценены как мера радиочувствительности на покадровых изображениях, собранных до тех пор, пока контрольные PDTO не достигнут заданного пространства заполнения.
Дистанционная лучевая терапия (ЛТ) является одним из столпов современной онкологии, отражая не только выраженную противоопухолевую активность, связанную с четко определенным спектром в целом управляемых побочных эффектов1, но и исключительно широкую клиническую доступность (большинство онкологических центров в развитых странах оснащены современными линейными ускорителями для дистанционной лучевой лучевой терапии)2. В соответствии с этим представлением, ЛТ успешно применяется во всем мире как в целях лечения, как правило, в контексте ранних стадий заболевания3....
Реагенты и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.
1. Органоидная культура
ПРИМЕЧАНИЕ: TNBC#1 PDTO были созданы в нашей лаборатории на основе опухолевой ткани, удаленной хирургическим п.......
TNBC#1 PDTO подвергались воздействию однократной дозы облучения 0 (необлученный контроль), 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр или 10 Гр в день 0. Сразу после этого PDTO диссоциировали для получения одноклеточной суспензии для каждого экспериментального условия. Затем клетки, полученные из PDTO, б.......
В данной работе мы описываем адаптацию традиционных клоногенных анализов, которая использует PDTO рака молочной железы и визуализацию в реальном времени для количественной оценки радиочувствительности PDTO на основе (1) стойкости PTDO-образующих стволовых клеток при облу.......
Мы благодарим Раймонда Брионеса и Вэнь Х. Шена (Weill Cornell Medical College, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США) за помощь в разработке данного протокола. Эта работа была поддержана грантом Консорциума по трансформационному раку молочной железы от BCRP Министерства обороны США (#W81XWH2120034, PI: Formenti).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
40 µm mesh filter | Thomas Scientific | 1164H35 | |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter | Nexcelom | ||
DMEM F/12 | Corning | 12634-010 | |
Epidermal Growth Factor hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope | Thermo Fisher Scientific | 12-563-460 | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
FGF7 | Peprotech | 100-19 | |
GlutaMax | Invitrogen | 35050061 | |
Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
IncuCyte software 2021A | Sartorius | version: 2021A | |
Incucyte SX1 | Sartorius | model SX1 | |
Incucyte validated 48 well plate | Corning | 3548 | |
Matrigel | Discovery Labware | 354230 | |
nAc | Sigma Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA | ||
Non-treated 6 well plate | Cellstar | 657 185 | |
NR (Heregulin) | Peprotech | 100-03 | |
p38 MAP inhibitor p38i SB202190 | Sigma Aldrich | S7067 | |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | |
Rspondin Media | Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA | ||
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP) | Xstrahl Ltd | ||
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01 | Tocris | 2939 | |
Trypan blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-61 | |
TrypLE | Gibco | 112605-028 | |
Y-27632 (RhoKi) | Selleck | S1049 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved