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Questo protocollo descrive il campionamento di sangue e urine per misurare i livelli di progesterone/estradiolo e gonadotropina corionica per determinare la fase del ciclo ovarico. I livelli ormonali vengono utilizzati per prevedere e determinare i tempi dell'ovulazione e gli ormoni vengono iniettati per regolare il ciclo ovarico e la crescita degli ovociti.
Gli uistitì comuni sono piccole scimmie del Nuovo Mondo. Poiché molti dei loro meccanismi biologici sono simili a quelli degli esseri umani, gli uistitì sono potenzialmente utili per la ricerca medica e di biologia umana in una vasta gamma di campi, come le neuroscienze, la medicina rigenerativa e lo sviluppo. Tuttavia, c'è una mancanza di letteratura che descriva i metodi per molti esperimenti e procedure di base. Qui vengono descritti metodi dettagliati per determinare i livelli di ormoni sessuali (progesterone, estradiolo e gonadotropina corionica) negli uistitì. La misurazione di questi ormoni consente di prevedere la fase del ciclo ovarico, che in genere è di 26-30 giorni negli uistitì; Una determinazione accurata è essenziale per il prelievo di ovociti/zigoti al momento giusto e per la preparazione delle femmine ospiti per la generazione di uistitì geneticamente modificati.
Inoltre, la misurazione dei livelli di ormoni sessuali è utile per gli studi di endocrinologia, etologia, sviluppo precoce e biologia riproduttiva. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata dei metodi per il prelievo di sangue dalla vena femorale, la separazione del plasma per la misurazione ormonale, la misurazione dei livelli di gonadotropina corionica utilizzando urina e plasma, il ripristino del ciclo ovarico utilizzando iniezioni di un analogo della prostaglandina F2α per abbreviare e sincronizzare il ciclo e promuovere la crescita follicolare e l'ovulazione iniettando l'ormone follicolo-stimolante e la gonadotropina corionica. Utilizzando questi protocolli, è possibile determinare le fasi del ciclo ovarico per la raccolta tempestiva di ovociti/zigoti.
L'uistitì comune (Callithrix jacchus) è una piccola scimmia del Nuovo Mondo con molte caratteristiche simili a quelle dell'uomo, e la durata del suo ciclo ovarico è di 26-30 giorni 1,2. Gli studi sullo sviluppo precoce e sulla generazione di uistitì geneticamente modificati richiedono il prelievo di ovociti e zigoti in fasi specifiche del ciclo ovarico. Pertanto, la determinazione accurata dello stadio è fondamentale e può essere stimata misurando i livelli ematici degli ormoni progesterone (P4) ed estradiolo (E2)2,3
Tutti i metodi che coinvolgono gli uistitì utilizzano elevati standard etici e di benessere e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il National Center for Child Health and Development. Gli animali utilizzati qui erano alloggiati in un solo alloggio o in coppia (una femmina e un maschio) con 12 ore di luce al giorno.
1. Prelievo di sangue dalla vena femorale
I dettagli relativi agli animali utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella 1.
Analisi anatomiche della vena femorale
Le analisi anatomiche della vena femorale sono state eseguite utilizzando un uistitì comune maschio di 2 anni (I 7713M) sottoposto a eutanasia. Le vene e le arterie femorali si trovano nel triangolo femorale. Il triangolo femorale si forma ai confini tra la parete addominale e i muscoli della c.......
La localizzazione della vena è il passaggio più critico nella raccolta del sangue. Sulla base di osservazioni anatomiche, questo protocollo introduce l'area prossimale nel triangolo femorale come un sito facile per la raccolta del sangue negli uistitì. Utilizzando quest'area, è possibile eseguire facilmente il prelievo di sangue da una vena di grandi dimensioni. Tuttavia, anche utilizzando questo protocollo, a volte si verificano lesioni a un'arteria. Quando si ferisce un'arteria, si.......
Vorremmo ringraziare Chunshen Shen, Hiroko Akutsu, Fumiyo Sugiki, Yuuna Hashimoto, Hina Naritomi, Yuuki Sakamoto e Mikiko Horigome per il loro supporto nella creazione di questo protocollo e nella cura quotidiana degli uistitì; Takayuki Mineshige per i commenti sul manoscritto; Yukiko Abe e i membri del laboratorio Aiba per aver condiviso le tecniche di raccolta degli zigoti; CIEA per aver condiviso le informazioni sulle abitazioni e gli esperimenti degli uistitì che hanno coltivato in 40 anni. Questa ricerca è stata supportata da AMED, JST e KAKENHI nell'ambito delle sovvenzioni n. JP19gm6310010, JP20gm6310010, JP21gm6310010 e JP22gm....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AIA-360 | Tosoh Corporation | 0019945 | Hormone measurement (P4/E2) |
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE | Tosoh Corporation | 0020956 | Hormone measurement (P4/E2) |
AIA-PACK SUBSTRATE SET II | Tosoh Corporation | 0020968 | Hormone measurement (P4/E2) |
AIA-PACK WASH CONCENTRATE | Tosoh Corporation | 0020955 | Hormone measurement (P4/E2) |
CMS-1 | CLEA Japan | Marmoset food | |
Estrumate | MSD Animal Health | PGF2alpha analog (cloprostenol) | |
Gonal-f Subcutaneous Injection 150 | Merck Biopharma Co., Ltd. | FSH | |
Gonatropin for intramuscular injection 1000 | ASKA Pharmaceutical Co., Ltd. | 872413 | hCG |
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | 224122458 | Blood collection |
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker) | CLEA Japan, Inc. | Determining CG level | |
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD | SHIOKAZE GIKEN | Desk lamp for blood collection | |
Marmoset blood collection restraint device | JIC Japan | JM-1006 | Blood collection http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html email: vi@jic-japan.jp |
Metacam 0.05% | Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd. | Hematoma treatment | |
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag | Globe Scientific | 110913 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK iE2 | Tosoh Corporation | 0025224 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET | Tosoh Corporation | 0025324 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION | Tosoh Corporation | 0025524 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK PROGIII | Tosoh Corporation | 0025240 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET | Tosoh Corporation | 0025340 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION | Tosoh Corporation | 0025540 | Hormone measurement (P4/E2) |
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle | TERUMO | SS-01T2525 | Blood collection |
Tensolvet 5.000 I.E. gel. | Dechra Pharmaceuticals | 14033492 | Hematoma treatment |
TOSOH MULTI-CONTROL SET | Tosoh Corporation | 0015965 | Hormone measurement (P4/E2) |
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