缺氧敏感的嵌合抗原受体-T 细胞的生成和功能验证

Summary

在这里，我们提出了一种用于产生和验证缺氧敏感的嵌合抗原受体 （CAR）-T 细胞的方案。该方案介绍了基于慢病毒的缺氧敏感 CAR-T 细胞的产生及其表征，包括缺氧依赖性 CAR 表达和选择性细胞毒性的验证。

Abstract

广泛的研究证明了嵌合抗原受体 T （CAR-T） 细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面的前景。然而，治疗实体瘤仍然具有挑战性，当 CAR-T 细胞攻击表达靶抗原的正常细胞时出现的安全问题就是例证。研究人员已经探索了提高 CAR-T 细胞疗法肿瘤选择性的各种方法。沿着这条路线的一个代表性策略是构建缺氧敏感的 CAR-T 细胞，其设计方法是将氧依赖性降解结构域融合到 CAR 部分，并且仅在缺氧环境 - 肿瘤微环境 （TME） 中实现高 CAR 表达。本文提出了一种产生此类 CAR-T 细胞及其功能表征的方案，包括分析响应移动培养箱建立的不同氧水平的 CAR 表达和杀伤能力变化的方法。预计构建的 CAR-T 细胞将以氧敏感方式展示 CAR 表达和细胞毒性，从而支持它们区分缺氧 TME 和常氧正常组织以进行选择性激活的能力。

Introduction

嵌合抗原受体 T 细胞 （CAR-T） 疗法代表了癌症治疗的重大突破。自 2017 年美国食品药品监督管理局 （FDA） 批准首个用于治疗晚期/耐药性淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病的 CAR-T 疗法以来，^1,2,3， 10 种靶向 CD19 或 B 细胞成熟抗原 （BCMA） 的 CAR-T 疗法已在全球范围内获得批准⁴。然而，尽管进行了广泛的研究，但复制 CAR-T 疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面的显着疗效对于其在实体瘤中的应用仍然具有挑战性 5,6,7,8。

免疫抑制性肿瘤微环境 （TME） 是 CAR-T 在实体瘤环境中疗效不佳的主要因素。由于营养不足、缺氧、酸性 pH 值和代谢废物的积累，TME 会阻碍 CAR-T 细胞的活性和存活

Protocol

在这项研究中，将 HER2-BBz-ODD，一种靶向 HER2 （基因 ID： 2064） 的缺氧敏感 CAR 与其常规对应物 HER2-BBz 进行了比较。两种 CAR 的示意图如图 1A 所示，其中显示 HER2-BBz-ODD 是通过将 ODD 序列添加到 CD3ξ 的 C 端而从 HER2-BBz 衍生而来的。表达两种 CAR 的慢病毒载体的构建以及通过 293T 细胞转染产生相应的慢病毒已在前面描述^{过 31}。

Discussion

安全问题是任何 CAR-T 细胞疗法进入临床使用都必须解决的重要问题。利用肿瘤细胞或 TME 的独特特性已成为专注于开发选择性靶向肿瘤组织的 CAR-T 细胞的主要研究方向。在这个方向上，设计缺氧敏感的 CAR-T 是一种有吸引力的策略，正在探索几种方法，包括本研究中提出的一种方法——将 CAR 部分与天然存在的缺氧感应 ODD 蛋白结构域融合。另一种方法涉及用缺氧反应元件.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge tube	QSP	509-GRD-Q	Supernatants and cells cellection Protocol Step 2,3,4
10% ExpressCast PAGE	NCM biotech	P2012	Immunoblotting Protocol Step 3
10x PBS	NCM biotech	20220812	Cell culture Protocol Step 4
10 mL pipette	Yueyibio	YB-25H	Pipetting Protocol Step 1
10xTRIS-Glycine-SDS electrophoresis buffer	Epizyme	3673020	Immunoblotting Protocol Step 3
15 mL Centrifuge tube	Thermo Scientific	339650	Supernatants and cells cellection Protocol Step 1
25 cm2 EasYFlask	Thermo Scientific	156367	Cell culture Protocol Step 3,4
4x Protein SDS PAGE Loading Buffer	Takara	9173	Immunoblotting Protocol Step 3
6-well flat-bottom tissue culture plates	Thermo Scientific	140675	T Cells culture Protocol Step 1
96-well black flat-bottom tissue culture plates	Greiner	655090	Cytotoxicity assay Protocol Step 4
96-well ELISA plates	Corning	3590	ELISA Protocol Step 5
96-well plate shaker	QILINBEIER	MH-2	Shake Protocol Step 4
96-well U-bottom tissue culture plates	Thermo Scientific	268200	Supernatants cellection Protocol Step 4,5
anti-FLAG antibody	Sigma	F1804-50UG	Immunoblotting Protocol Step 3
Carbinol	Sinopharm	10010061	Immunoblotting Protocol Step 3
Carbon dioxide incubator	Thermo Scientific	360	Cell culture Protocol Step 1,2,3,4
Cell counting plate	Hausser scientific	1492	Cell counting Protocol Step 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG Kit	Thermo Scientific	11531D	Mouse IgG magnetic beads Protocol Step 1
Centrifuge	Thermo Scientific	75002432	Cell culture Protocol Step 1,3,4
Chemiluminescence gel imaging system	BIO-RAD	12003154	Immunoblotting Protocol Step 3
Cobalt chloride solution (0.5 M)	bioleaper	BR4000203	Hypoxic condition Protocol Step 2,3,4
DMEM	Corning	10-103-CV	Cell culture Protocol Step 4
Electronic balance	Sartorius	PRACTUM612-1CN	weigh Protocol Step 5
FBS	BI	04-001-1ACS	Cell culture Protocol Step 3,4
GAPDH Mouse mAb	ABclonal	AC002	Immunoblotting Protocol Step 3
Gel electrophoresis apparatus	BIO-RAD	1645070	Immunoblotting Protocol Step 3
GloMax Microplate Readers	Promega	GM3000	luciferase activity measurement Protocol Step 4
Goat anti-Mouse IgG (H+L)	Yeasen	P1126151	Immunoblotting Protocol Step 3
High speed microfreezing centrifuge	eppendorf	5810 R	Cell culture Protocol Step 1
Human IFN-γ ELISA Set	BD	555142	ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IFN-γ Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IFN-γ , Capture Antibody Purified Anti-Human IFN-γ, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
Human IL-2 ELISA Set	BD	555190	ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IL-2 Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IL-2 , Capture Antibody Purified Anti-Human IL-2, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
IL-15	R&D systems	P40933	T Cells culture Protocol Step 1
IL-21	Novoprotein	GMP-CC45	T Cells culture Protocol Step 1
IL-7	R&D systems	P13232	T Cells culture Protocol Step 1
Inverted microscope	Olympus	CKX41	Cell culture Protocol Step 1,3,4
Jurkat	ATCC	TIB-152	CAR-Jurkat construction Protocol Step 3
LSRFortessa	BD	LSRFortessa	Flow cytometry Protocol Step 2
Luciferase Assay System	Promega	E1501	luciferase reporter assay Protocol Step 4 Items: Passive lysis buffer, firefly luciferase substrate
Microplate reader	BioTek	HTX	ELISA Protocol Step 5
mobile CO2/O2/N2 Incubator Chamber	China Innovation Instrument Co., Ltd.	Smartor118	Hypoxic condition Protocol Step 2, 3, 4
Mouse Anti-Hexa Histidine tag	Sigma	SAB2702218	Immunoblotting Protocol Step 3
NcmBlot Rapid Transfer Buffer	NCM biotech	WB4600	Immunoblotting
NcmECL Ultra	NCM biotech	P10300	Immunoblotting Protocol Step 3 Items: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A) ,NcmECL Ultra Stabilized Peroxide Reagent (B)
NovoNectin -coated 48-well flat plates	Novoprotein	GMP-CH38	CAR-T cells construction Protocol Step 1
OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) tablet set	Sigma	P9187	Substrate Reagent Protocol Step 5 Items: OPD tablet (silver foil),urea hydrogen peroxide tablet (gold foil)
PE-conjugated anti-DYKDDDDK	Biolegend	637310	Flow cytometry Protocol Step 2
Protamine sulfate	Sigma	P3369-1OG	Lentivirus infection Protocol Step 1
Protein Marker 10 Kda-250 KDa	Epizyme	WJ102	Immunoblotting Protocol Step 3
Purifed NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	566685	T Cells culture Protocol Step 1
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725	T Cells culture Protocol Step 1
PVDF membrane	Millipore	168627	Immunoblotting Protocol Step 3
RPMI 1640	Corning	10-040-CVRC	Cell culture Protocol Step 3
Skim milk powder	Yeasen	S9129060	Immunoblotting Protocol Step 3
SKOV3-Luc	ATCC	HTB-77	Cytotoxicity assay Protocol Step 4
Trypsin-EDTA	NCM biotech	C125C1	Cell culture Protocol Step 4
Tween 20	Sinopharm	30189328	Immunoblotting Protocol Step 3
Water bath	keelrein	NB014467	Heating Protocol Step 1
X-VIVO 15	LONZA	04-418Q	Serum-free lymphocyte culture medium Protocol Step 1