A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
В данной работе представлен протокол генерации и функциональной верификации чувствительных к гипоксии химерных антигенных рецепторов (CAR)-Т-клеток. В этом протоколе представлено поколение чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток на основе лентивируса и их характеристика, включая валидацию гипоксически-зависимой экспрессии CAR и селективной цитотоксичности.
Обширные исследования доказали перспективность терапии химерными антигенными рецепторами T (CAR-T) клетками в лечении гематологических злокачественных новообразований. Тем не менее, лечение солидных опухолей остается сложной задачей, о чем свидетельствуют опасения по поводу безопасности, которые возникают, когда CAR-T-клетки атакуют нормальные клетки, экспрессирующие целевые антигены. Исследователи изучили различные подходы к повышению селективности опухоли при терапии CAR-T-клетками. Одной из типичных стратегий в этом направлении является конструирование чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток, которые сконструированы путем слияния кислород-зависимого домена деградации с CAR-фрагментом и разработаны для достижения высокой экспрессии CAR только в гипоксической среде — опухолевом микроокружении (TME). В данной работе представлен протокол генерации таких CAR-T-клеток и их функциональная характеристика, включая методы анализа изменений экспрессии CAR-клеток и убивающей способности в ответ на различные уровни кислорода, установленные в камере мобильного инкубатора. Ожидается, что сконструированные CAR-T-клетки будут демонстрировать экспрессию CAR и цитотоксичность чувствительным к кислороду образом, тем самым поддерживая их способность различать гипоксические TME и нормоксические нормальные ткани для селективной активации.
Терапия химерными антигенными рецепторами Т-клеток (CAR-T) представляет собой значительный прорыв в лечении рака. С тех пор как в 2017 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило первую CAR-T-терапию для лечения прогрессирующей/резистентной лимфомы и острого лимфобластного лейкоза, 1,2,3, 10 CAR-T-терапий, нацеленных на CD19 или антиген созревания B-клеток (BCMA), получили одобрение во всем мире4. Однако, несмотря на обширные исследования....
В этом исследовании HER2-BBz-ODD, чувствительный к гипоксии CAR, нацеленный на HER2 (Gene ID: 2064), сравнивался со своим обычным аналогом, HER2-BBz. Схемы двух CAR проиллюстрированы на рисунке 1A, который показывает, что HER2-BBz-ODD является производным от HER2-BBz путем добавления ?.......
Слияние домена ODD HIF-1α с фрагментом CAR представляет собой основную стратегию для создания чувствительного к гипоксии CAR. Чувствительный к гипоксии HER2-нацеленный на CAR, проанализированный в этом исследовании, названный HER2-BBz-ODD, был сконструирован с использованием этой с.......
Проблемы безопасности являются важными вопросами, которые должны быть решены для того, чтобы любая терапия CAR-T-клетками продвинулась в клиническое применение. Использование уникальных свойств опухолевых клеток или ТМЭ стало основным направлением исследований, напр.......
Эта работа была поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2016YFC1303402), Национального мегапроекта по ключевым инфекционным заболеваниям (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007) и Общей программы Шанхайской муниципальной комиссии здравоохранения (201740194).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Centrifuge tube | QSP | 509-GRD-Q | Supernatants and cells cellection Protocol Step 2,3,4 |
10% ExpressCast PAGE | NCM biotech | P2012 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
10x PBS | NCM biotech | 20220812 | Cell culture Protocol Step 4 |
10 mL pipette | Yueyibio | YB-25H | Pipetting Protocol Step 1 |
10xTRIS-Glycine-SDS electrophoresis buffer | Epizyme | 3673020 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
15 mL Centrifuge tube | Thermo Scientific | 339650 | Supernatants and cells cellection Protocol Step 1 |
25 cm2 EasYFlask | Thermo Scientific | 156367 | Cell culture Protocol Step 3,4 |
4x Protein SDS PAGE Loading Buffer | Takara | 9173 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
6-well flat-bottom tissue culture plates | Thermo Scientific | 140675 | T Cells culture Protocol Step 1 |
96-well black flat-bottom tissue culture plates | Greiner | 655090 | Cytotoxicity assay Protocol Step 4 |
96-well ELISA plates | Corning | 3590 | ELISA Protocol Step 5 |
96-well plate shaker | QILINBEIER | MH-2 | Shake Protocol Step 4 |
96-well U-bottom tissue culture plates | Thermo Scientific | 268200 | Supernatants cellection Protocol Step 4,5 |
anti-FLAG antibody | Sigma | F1804-50UG | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Carbinol | Sinopharm | 10010061 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Carbon dioxide incubator | Thermo Scientific | 360 | Cell culture Protocol Step 1,2,3,4 |
Cell counting plate | Hausser scientific | 1492 | Cell counting Protocol Step 1,3,4 |
CELLection Pan Mouse IgG Kit | Thermo Scientific | 11531D | Mouse IgG magnetic beads Protocol Step 1 |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75002432 | Cell culture Protocol Step 1,3,4 |
Chemiluminescence gel imaging system | BIO-RAD | 12003154 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Cobalt chloride solution (0.5 M) | bioleaper | BR4000203 | Hypoxic condition Protocol Step 2,3,4 |
DMEM | Corning | 10-103-CV | Cell culture Protocol Step 4 |
Electronic balance | Sartorius | PRACTUM612-1CN | weigh Protocol Step 5 |
FBS | BI | 04-001-1ACS | Cell culture Protocol Step 3,4 |
GAPDH Mouse mAb | ABclonal | AC002 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Gel electrophoresis apparatus | BIO-RAD | 1645070 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
GloMax Microplate Readers | Promega | GM3000 | luciferase activity measurement Protocol Step 4 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Yeasen | P1126151 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
High speed microfreezing centrifuge | eppendorf | 5810 R | Cell culture Protocol Step 1 |
Human IFN-γ ELISA Set | BD | 555142 | ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IFN-γ Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IFN-γ , Capture Antibody Purified Anti-Human IFN-γ, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP) |
Human IL-2 ELISA Set | BD | 555190 | ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IL-2 Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IL-2 , Capture Antibody Purified Anti-Human IL-2, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP) |
IL-15 | R&D systems | P40933 | T Cells culture Protocol Step 1 |
IL-21 | Novoprotein | GMP-CC45 | T Cells culture Protocol Step 1 |
IL-7 | R&D systems | P13232 | T Cells culture Protocol Step 1 |
Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Cell culture Protocol Step 1,3,4 |
Jurkat | ATCC | TIB-152 | CAR-Jurkat construction Protocol Step 3 |
LSRFortessa | BD | LSRFortessa | Flow cytometry Protocol Step 2 |
Luciferase Assay System | Promega | E1501 | luciferase reporter assay Protocol Step 4 Items: Passive lysis buffer, firefly luciferase substrate |
Microplate reader | BioTek | HTX | ELISA Protocol Step 5 |
mobile CO2/O2/N2 Incubator Chamber | China Innovation Instrument Co., Ltd. | Smartor118 | Hypoxic condition Protocol Step 2, 3, 4 |
Mouse Anti-Hexa Histidine tag | Sigma | SAB2702218 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
NcmBlot Rapid Transfer Buffer | NCM biotech | WB4600 | Immunoblotting |
NcmECL Ultra | NCM biotech | P10300 | Immunoblotting Protocol Step 3 Items: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A) ,NcmECL Ultra Stabilized Peroxide Reagent (B) |
NovoNectin -coated 48-well flat plates | Novoprotein | GMP-CH38 | CAR-T cells construction Protocol Step 1 |
OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) tablet set | Sigma | P9187 | Substrate Reagent Protocol Step 5 Items: OPD tablet (silver foil),urea hydrogen peroxide tablet (gold foil) |
PE-conjugated anti-DYKDDDDK | Biolegend | 637310 | Flow cytometry Protocol Step 2 |
Protamine sulfate | Sigma | P3369-1OG | Lentivirus infection Protocol Step 1 |
Protein Marker 10 Kda-250 KDa | Epizyme | WJ102 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Purifed NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 566685 | T Cells culture Protocol Step 1 |
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | T Cells culture Protocol Step 1 |
PVDF membrane | Millipore | 168627 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVRC | Cell culture Protocol Step 3 |
Skim milk powder | Yeasen | S9129060 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
SKOV3-Luc | ATCC | HTB-77 | Cytotoxicity assay Protocol Step 4 |
Trypsin-EDTA | NCM biotech | C125C1 | Cell culture Protocol Step 4 |
Tween 20 | Sinopharm | 30189328 | Immunoblotting Protocol Step 3 |
Water bath | keelrein | NB014467 | Heating Protocol Step 1 |
X-VIVO 15 | LONZA | 04-418Q | Serum-free lymphocyte culture medium Protocol Step 1 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved