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Summary

在本文中，我们提供了一种可重复的方法来生成和维持移植神经干细胞的长期脊髓器官型切片，作为测试细胞替代疗法的 离体 模型。

Abstract

由于病理生理学复杂的脊髓损伤 （SCIs） 方法仍然缺乏。最有前途的再生方法之一是基于干细胞移植，以替换丢失的组织并促进功能恢复。在进行更昂贵和耗时的动物试验之前，应 在体外 和 体外 更好地探索这种方法的安全性和有效性。在这项工作中，我们展示了建立一个基于小鼠脊髓 （SC） 器官型切片移植人类神经干细胞的长期平台，以测试 SCI 的细胞替代疗法。

标准 SC 器官型培养物 在体外维持约 2 或 3 周。在这里，我们描述了一种优化的协议，用于长达 90 天的长期维护（≥30 天）。用于长期培养 SC 切片的培养基也针对将神经干细胞移植到器官型模型中进行了优化。将携带绿色荧光蛋白 （GFP） 报告基因的人 SC 衍生神经上皮干 （h-SC-NES） 细胞移植到小鼠 SC 切片中。移植后30天，细胞仍显示GFP表达和低凋亡率，表明优化的环境维持了它们在组织内的存活和整合。该协议代表了在SC组织中有效测试细胞替代疗法的有力参考。该平台将使研究人员能够对不同的细胞移植疗法进行 体外 预筛选，帮助他们在进行 体内 实验之前选择最合适的策略。

Introduction

创伤性脊髓损伤 （SCI） 对患者和护理人员的身体、心理和经济后果1.已经进行了许多尝试，以不同的方法促进 SCI 中的轴突再生 2,3,4，并且通过细胞替代疗法在损伤部位的近端和远端神经元之间形成神经元中继，证明了一些有益的效果。人们对细胞疗法的兴趣仍在增长5，因为移植细胞可以发挥许多作用，包括提供营养支持、免疫调节、通过诱导可塑性再生丢失的神经回路、细胞替换和轴突髓鞘再生6。

最近，该领域的主要工作集中在人类神经干/祖细胞 （NSC/NPC） 上7。几项研究表明，NSCs/NPCs 调节星形胶质细胞反应8，促进促再生因子的分泌 9,10，并替换 SCI 中缺失的神经元细胞11,12。然而，支持移植细胞分化为功能性神经元的研究仍然很差。此外，移植细胞在损伤脊髓 （SC） 中的存活率和分化率低13，可能是因为移植细胞需要数周甚至数月才能在体内分化。此外，目前的研究尚未完全阐明细胞替代疗法的许多生化、分子、细胞和功能方面。在这种情况下，需要简单、快速且具有成本效益的模型来研究细胞植入的机制、移植细胞增殖、分化成特定类型或细胞亚群的能力，以及与驻留神经元形成突触的能力。

将组织学研究整合到电生理记录以及转录组和蛋白质组分析中，对于全面理解细胞移植后发生的分子级联反应是必要的。这无疑将加快临床前模型和临床研究中新细胞替代疗法的设计和验证。事实上，迄今为止，使用啮齿动物、大型动物和非人灵长类动物对于阐明移植后的许多细胞过程是值得的14.然而，由于成本高、伦理影响大以及生物体的复杂性，它们的使用往往不直接或不足以揭示生化和分子过程。此外，它们可能存在许多与生物学差异相关的缺点，包括种间（代谢）和种内变异性（性别、年龄）。 这些因素，加上压力情况等外部因素，可能会改变实验的结果及其在对人类的治疗转化方面的可预测性15,16,17。

因此，除了动物模型外，许多研究小组还采用2D体外细胞培养和离体器官型切片（离体培养）。2D细胞培养是在单细胞和/或细胞群水平上研究特定生物过程的最常用系统。然而，单层细胞培养并不能反映在整个生物体中发现的复杂性。缺乏组织结构和生理环境使得 2D 培养系统无法完全模拟所研究组织的关键结构、形态和功能方面 18,19,20。器官型培养可以克服其中的一些问题。器官型模型基于移植组织或器官的片段并将其在有限的时间内保持在体外21,22。特别是，外植组织的切片以精确的厚度生成，使营养物质能够轻松到达切片中的几乎所有细胞。它们可以从中枢神经系统的各个区域产生，例如海马体、下丘脑、小脑、丘脑、大脑皮层、黑质和纹状体以及脊髓23。器官型培养保留了组织结构、细胞的空间分布、细胞多样性和起源器官的环境（即细胞外基质组成）。此外，它们保留了原始的神经活动，细胞之间的连接，特别是外植体后的短距离回路。

与单层培养物和动物模型相比，这些方面为离体培养物提供了一些优势。它们保留了体内发现的关键组织特征，但降低了成本，并有可能进行不同类型的分子、细胞和功能实验，并准确调节培养环境参数 24,25,26,27,28,29.器官型切片也可用于通过类似于特定疾病的关键组织病理学特征来开发不同神经系统疾病的模型30。此外，原始多细胞组织环境的保留使它们成为药物筛选和测试神经保护和神经再生分子和材料的合适平台。

在这项工作中，我们建议使用 SC 器官型培养物作为模型来优化 NSC 移植。这并非微不足道，因为需要最佳的培养条件来保证宿主（SC组织）和移植物（NSC）数周的存活。不同的研究小组移植到器官型培养物中，脑源性和SC衍生的各种类型的细胞。大多数工作展示了间充质干细胞31,32,33，嗅鞘细胞34或NSCs的移植35,36,37,38,39,40，并评估了移植细胞与宿主细胞的相互作用，整个系统的存活率，以及移植的细胞是否分化为神经元或神经元样细胞在离体组织环境中 32,33,41。他们中的一些人评估了移植后细胞的再生潜力，观察它们在组织内的轴突生长37,40,41，少突胶质细胞移植前体的髓鞘化能力42，移植细胞向宿主组织的迁移43，以及移植细胞是否释放了推动促再生环境的因子31.目前研究的一个局限性是它们没有长期探索植入。

考虑到 NSC 似乎需要数周时间才能在体内分化 44,45，本研究的重点是如何生成和维持长期（≥30 天）小鼠 SC 切片长达 90 天。研究发现，切片保留了其原始的解剖结构，并随着时间的推移保持低而稳定的凋亡率和高细胞活力。我们观察到神经元标记物 RNA 结合 fox-1 同源物 3 （RBFOX3） 和神经丝轻链 （NFL） 的弥漫表达，随着时间的推移，后者在切片周围轴突发芽呈增加趋势，证明了它们的健康状况。此外，在神经元分化的第一阶段，我们成功地将表达GFP的人SC衍生的神经上皮干（h-SC-NES）移植到SC切片中。移植后维持 NSC 移植物 30 天，细胞在培养的所有期间均显示 GFP 表达。还发现移植后第二天 （DPT） 30 的细胞凋亡率与相同细胞40 中在 DPT 7 处观察到的凋亡率值一致。 细胞似乎植入组织环境并存活长达数周。

总之，我们的数据表明，可以在培养物中将 SC 器官型切片维持 3 个月，而不会影响其原始细胞结构和组织环境。最重要的是，它们可以用于在进行 体内 实验之前测试细胞疗法，从而降低成本和实验时间。在这里，我们详细说明了产生小鼠SC器官型切片的所有段落以及如何长期（≥30天）维持它们。此外，我们还深入解释了如何将鼻咽癌移植到切片中，以及如何保持鼻咽癌以进行下游分析。

Protocol

动物程序严格按照意大利公共卫生部和比萨大学当地伦理委员会批准的协议进行，符合指令2010/63/EU（项目许可证号39E1C）。N.5Q7 于 2021 年 10 月 30 日发布）。将C57BL / 6J小鼠置于调节环境（23±1°C，50±5%湿度）中，光暗循环12小时， 随意食物和水。

所有与h-SC-NES细胞相关的工作均根据美国国立卫生研究院（NIH）关于为生物医学研究目的获取和分配人体组织的指南进行，并得到每个获得样本的研究所的人类调查委员会和机构伦理委员会的批准。比萨大学生物伦理委员会已获得最终批准（第29/2020号审查）。去识别化的人类标本由 MRC/Wellcome Trust 联合赠款 （099175/Z/12/Z）、人类发育生物学资源 （www.hdbr.org） 提供。获得了适当的知情同意，并记录了每个标本的所有可用的非识别信息。组织是根据 NIH （http://bioethics.od.nih.gov/humantissue. html） 和 WMA 赫尔辛基宣言 （http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html） 制定的人类脑组织研究使用的伦理准则和规定进行处理的。

1. 脊髓（SC）分离和培养溶液和设备的制备

  1. 膜插件的涂层解决方案
    1. 制备包衣溶液（表1）：含有0.1 mg mL-1胶原蛋白，0.01 mg mL-1聚-L-赖氨酸和0.01 mg mL-1层粘连蛋白的水溶液。
    2. 将每个膜插入物放入 35 mm 培养皿或 6 孔板中。
    3. 向膜顶部加入 1 mL 包被溶液：将溶液在室温 （RT） 下孵育 4 小时;然后，将其取出，让膜插入物干燥过夜 （ON）。将膜插入物储存在4°C直至使用。
      注意：所有传代均应在无菌条件下进行。使用前，膜包被应在4°C下保存最多1周，以避免蛋白质降解和切片与膜的粘附力欠佳。
  2. 培养基制备：器官型培养基、解剖培养基、移植培养基
    1. 制备器官型培养基（OM， 表1）。
    2. 如 表1所述准备解剖培养基。
    3. 准备接枝培养基（GM，优化自Onoratí等人46， 表1）。
      注意：溶液应在无菌条件下制备，并在使用前（实验前 1 天或同一天）制备。
  3. 手术材料准备
    1. 在生物安全柜中，请准备好以下物品以备使用：解剖立体显微镜和手术器械：两把微型剪刀、两把直镊子和两对弯曲的镊子。
    2. 在生物安全柜中，为切碎器仪器配备刀片，将SC切成薄片，以准备切碎器仪器。旋转斩波器的螺丝，将金属臂提起应放置刀片的位置。将刀片放置在指定位置，用刀片降低金属臂，直到它接触到切割台，然后用六角扳手拧紧固定螺钉，直到刀片牢固固定。将测微螺杆旋转到所需的切片厚度（通常为 350 μm）。检查刀片是否精确垂直于切割台放置。
      注意： 刀片相对于切割台精确垂直放置对于正确执行切割是必要的。
    3. 在生物安全柜中准备：两个塑料巴斯德移液器（需要移动分离的SC和切片），至少四个35毫米和两个60毫米的培养皿，以及一盒新鲜冰。
    4. 在使用前用70%乙醇和紫外线（一个20分钟的循环）对所有仪器进行灭菌，以保持培养无菌。

2. 小鼠SC的分离和切片的生成

  1. 小鼠SC的分离
    1. 根据项目许可证处死出生后第 3 天 （P3） 小鼠幼崽。
    2. 通过使用微剪刀进行中线剖腹手术，将脊柱的腰部区域与小鼠身体的其余部分隔离开来，并将其放入35毫米培养皿中的冷解剖培养基中。
    3. 使用解剖立体显微镜和微型剪刀，沿矢状轴切开脊柱骨架，并使用直镊子轻轻从脊柱腔中取出脊柱侧突。
    4. 使用直镊子小心地从SC的孤立腰部区域剥离脑膜。
    5. 将分离的 SC 腰椎区域在冷和新鲜的解剖培养基中转移和孵育 10-15 分钟，然后再进行下一步。
  2. 切片的生成
    1. 通过使用一个塑料巴斯德移液器，从解剖培养基中取出分离的SC腰部区域，并将其放置在斩波器仪器的切割台上，垂直于刀片。
      注意： SC 相对于刀片（垂直）的正确定位对于正确生成 SC 切片至关重要。
    2. 在巴斯德移液管和无菌吸收纸的帮助下，去除SC周围甲板上的残留解剖介质。继续进行 SC 自动切片。
    3. 生成切片后，将一些带有巴斯德移液管的新鲜解剖培养基与切片一起放在切割台上。然后，将切片收集到装有新鲜解剖培养基的 35 毫米培养皿中，并孵育 15 分钟。
    4. 在切片孵育期间，使用塑料巴斯德移液管用OM清洗膜插入物的表面3次。然后，在每个膜插入物的底部留下 1 mL OM。
    5. 在解剖体视显微镜下检查切片。通过用塑料巴斯德移液管转移它们，在调节的膜插入物上播种所需数量的切片。
    6. 在直镊子的帮助下，将切片按首选方向和所需位置移动到膜插入物上。用巴斯德移液管去除多余的培养基，使切片更好地粘附在膜表面。
      注意： 使用直镊子移动和定向切片应轻柔地进行，以避免组织或膜插入物损坏。
    7. 在37°C孵育30分钟后，将插入物转移到新的培养皿中。
      注意： 在更换培养基期间，请触摸塑料环，但不要触摸膜。
    8. 在膜插入物底部加入 1 mL 补充有神经胶质细胞系衍生神经营养因子 （GDNF） 100 ug mL-1 的新鲜 OM。
    9. 将切片在37°C孵育。 将培养中的第一天称为 离体 日 （DEV） 0。

3. 器官型切片的长期培养

  1. 将切片在37°C的培养物中保持至所需的时间点。
  2. 按照步骤 2.2.7-2.2.8 中所述，在 DEV 1 处用新鲜的 OM 替换培养基。
  3. 在 DEV 3 时，将培养基切换到 GM，以创造第二天移植干细胞的适当环境。每 48 小时用新鲜的 GM 替换培养基（例如，DEV 5、DEV 7......
  4. 每天向培养基中加入新鲜的 GDNF（终浓度 100 μg mL-1），直至 DEV 7。在 DEV 7 之后，仅在介质更改时添加它（步骤 3.3）。

4. h-SC-NES细胞培养

注意：h-SC-NES细胞在生长因子（NES培养基，步骤4.1.1）存在下维持在培养物中。在移植之前，通过从培养基中去除生长因子（预分化培养基：不含成纤维细胞生长因子2（FGF-2）和表皮生长因子（EGF）的NES培养基，步骤4.1.2），将细胞置于预分化条件下7天。然后，在移植前将细胞置于分化条件（分化培养基，步骤4.1.3）中2天。通过在分化培养基中添加神经营养补充剂（脑源性神经营养因子，BDNF）来支持分化。h-SC-NES细胞12,46的维持、分裂、预分化和分化如下所述。

  1. 培养基制备：NES、预分化和分化培养基
    1. 制备h-SC-NES细胞维持培养基（NES培养基， 表1）。
    2. 制备h-SC-NES细胞预分化培养基（预分化培养基， 表1）。
    3. 制备h-SC-NES细胞分化培养基（分化培养基， 表1）。当更换培养基或在分化条件下首次接种细胞时，新鲜添加 BDNF。
      注意：所有培养基应在无菌条件下制备，并应用0.22μm过滤器过滤。
  2. h-SC-NES电池包被解决方案
    注意：h-SC-NES 细胞维持在 POLFN 包被的培养支持物中（POLFN = 聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白）。
    1. 在试管中制备包衣溶液：含有层粘连蛋白（5μgmL - 1）和纤连蛋白（1μg mL - 1）的聚-L-鸟氨酸溶液。
    2. 将制备的包被溶液转移到细胞培养支持物中，注意添加足够的溶液以覆盖细胞培养支持物的整个表面。将涂层在37°C孵育1小时或在4°C下孵育过夜。
    3. 从细胞培养支持物中去除包被溶液。
      注意：POLFN 溶液可以再循环两次，但层粘连蛋白和纤连蛋白每次都应新鲜添加。
    4. 用细胞培养级无菌水清洗涂层 3 次。将涂层储存在4°C或使用它。
      注意：涂料应在 1 周内使用。之后，由于添加的蛋白质的降解过程，涂层被认为是过期的。
  3. h-SC-NES电芯维护
    1. 在NES培养基中维持h-SC-NES细胞的培养。每天在显微镜下检查细胞，以监测它们何时到达汇合处。
    2. 每 2 天更换一半的培养基：取出一半的调节培养基并加入新鲜的培养基（考虑 20% 蒸发率）。
    3. 如果细胞达到汇合点，则按照步骤 4.4 中所述进行分裂。
  4. h-SC-NES细胞传代
    注意：单元格按以下方式拆分12：
    1. 取出经过处理的培养基，用不含 Ca2+/Mg2+ 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 洗涤细胞一次。
    2. 去除DPBS，向细胞中加入胰蛋白酶/EDTA溶液进行酶促分离。将细胞在37°C孵育30秒至1分钟。
    3. 孵育后，在显微镜下检查细胞：如果它们没有分离，轻轻敲击细胞培养支持以进行机械分离，并将它们在37°C下孵育30秒以上。
    4. 孵育后，通过向含有细胞和胰蛋白酶/EDTA 的细胞培养支持物中加入 4 体积的 DPBS/胎牛血清 （FBS）（10% 体积/体积）溶液来灭活胰蛋白酶/EDTA。轻轻地将溶液移液到细胞培养支持表面上下，以帮助所有细胞分离。将细胞悬液收集在试管中。
    5. 将细胞悬液以 200 × g 离心 3 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于新鲜的NES培养基中。
    6. 对细胞进行计数，并以 ̴0.5-1 × 105 个细胞/cm2 的密度将它们接种在每个新的 POLFN 包被的培养支持物上。
    7. 加入Y-27632（10μM）并将细胞置于37°C。 每天检查它们直到汇合，然后再次将它们分开进行维护/扩展或细胞库。
  5. h-SC-NES细胞预分化
    1. 按照步骤 4.4 中所述拆分单元格。
    2. 在预分化培养基中，将细胞以 ̴0.5-1 × 105 个细胞/cm2 的密度接种在 POLFN 包被的细胞培养物上。 分裂后加入Y-27632（10μM）。称体 外 预分化日（DIV）为0。
    3. 每 2-3 天更换一半的培养基（参见步骤 4.3.2）。
    4. 将细胞保持在预分化状态直到 DIV 7，然后继续进行步骤 4.6。
  6. h-SC-NES细胞分化
    1. 在预分化的 DIV 7 处，按照步骤 4.4 中所述分裂细胞。
    2. 在分化培养基中，将细胞以 ̴1-1.5 × 105个细胞/cm2的密度铺板在 POLFN 包被的细胞培养物上。 分裂后加入 Y-27632 （10 μM） 和 BDNF （30 ng mL-1）。
    3. 分化 2 天 （DIV 10） 后，将用于移植的细胞分成薄片。

5. h-SC-NES细胞转导与携带GFP的慢病毒载体

注：细胞转导在h-SC-NES细胞的维持阶段进行。当细胞正确转导时，这些细胞可以扩增并应用先前描述的预分化和分化方案（步骤 4.5 和 4.6）。

  1. 细胞转导培养基的制备
    注：细胞转导培养基是通过混合特定体积的NES培养基和精确体积的慢病毒载体储备液（LVS）制备物来制备的，根据不同的参数：所需的MOI（感染的多重性=病毒颗粒的数量与给定感染培养基中宿主细胞的数量之比）;电镀细胞的数量;LVS制剂的初始浓度（=LVS PFU，斑块形成单位）;所用培养容器的表面积。
    1. 根据选定的MOI，使用公式（1）和（2）计算要添加到NES培养基中的LVS制剂的正确体积。
      （N 个细胞到板/cm2） × cm2 的细胞培养支持物 × MOI = 所选 MOI 的 LVS PFU （1）
      LVS PFU：Tot 初始 LVS 体积 （μL） = MOI 的 LVS PFU：添加到培养基中的 LVS 体积 （μL）（2）
      注意： LVS PFU （LVS 的初始 PFU）和 总初始 LVS 体积 由制造商给出。 所选 MOI 的 LVS PFU 的计算方法如公式 （1） 所示。因此，我们可以获得必须 添加到所选 MOI 的 NES 培养基总体积 （基于细胞培养支持）中的 LVS 制剂体积，如公式 （2） 中所述。
      示例：根据以前的实验室经验，我们使用了 MOI 3（MOI 可能因使用的细胞系和病毒制备物而异）。如果所需的MOI为3，则待接种的细胞数为0.5 × 105/cm2，培养支持物为1孔-MW24（2cm2），假设初始LVS PFU/TU（噬菌斑形成单位/转导单位）为1 mL（1,000μL =初始LVS vol）中的25 ×10 6 PFU，计算如下：
      接种在 1 孔 MW24 （2 cm2） 中的细胞 = 0.5 × 105 个细胞 × 2 cm2 = 1 × 105 个细胞
      1 × 105 个细胞 × 3 （MOI） = 3 × 105 PFU = MOI 3 的 LVS PFU
      25 × 106 PFU：1,000 μL = 3 × 105 PFU：x μL
      x μL = 12 μL = 添加到培养基中的 LVS 体积
      因此，要在 1 孔 MW24 中使用 MOI 3 的 细胞转导培养基 转导细胞，将 12 μL 初始 LVS 制备物添加到为 1 孔 MW24 制备的 NES 培养基 （238 μL） 中。最终总体积为 250 μL。
      注：培养基通常在转导当天在无菌条件下新鲜制备。
  2. h-SC-NES转导实验方案
    1. 在 NES 培养基中，以 0.5 × 105/cm2 的密度在 POLFN 包被的 24 多孔板（或任何其他培养支持物）上低传代接种 h-SC-NES 细胞。
    2. 第二天，从铺板细胞的孔中收集经过调节的NES培养基。根据所选的培养支持物，向细胞中加入均匀覆盖接种表面所需的最低体积的新鲜细胞转导培养基（例如，250 μL/孔的 24 多孔板）。
    3. 然后，将h-SC-NES细胞在37°C下孵育6小时。 之后，将先前收集的条件培养基添加到细胞中（200μL/24多孔板的孔）并将细胞在37°C下孵育。
    4. 第二天，用DPBS洗涤h-SC-NES细胞一次，并进行总培养基更换（NES培养基）。
    5. 接下来的几天，在荧光显微镜下检查细胞以观察GFP表达。
    6. 扩增用于细胞库和移植的 h-SC-NES 细胞。

6. 细胞移植到SC切片和共培养

  1. 玻璃微针的制备
    1. 使用拉拔器从硼硅酸盐玻璃毛细管中获得细针。按如下方式设置拉拔器： HEAT 990、PULL 350。
      注意：从一个毛细管中，可以获得两个细针。
  2. 移植的细胞制备
    1. 按照步骤 4.4 中所述拆分单元格。
      注意：如果细胞不表达荧光报告基因，则用细胞示踪染料标记它们，以便在移植后和长期培养期间使用荧光显微镜监测它们。按照所选制造商的协议进行标签步骤。
    2. 对分裂后的细胞进行计数，并以 200 × g 离心 3 分钟。用新鲜培养基+ Y-27632（10μM）悬浮获得的沉淀，以获得所需的细胞浓度（通常在30,000-50,000个细胞μL-1之间的范围）。
    3. 将细胞悬液转移到 500 μL 或 1.5 mL 试管中，并将其置于冰上。细胞已准备好进行移植。
  3. 细胞移植到器官型切片中
    注意：使用空气显微注射器和玻璃微针将 h-SC-NES 细胞移植到小鼠 SC 器官型切片中。
    1. 使用微量移液管和微量装载器吸头将 4 μL 细胞悬液加载玻璃微针。
      注意：避免在针头中形成气泡，因为它可能会妨碍显微注射过程。如果形成气泡，请用微量移液器将其清除。
    2. 将针头放在显微注射器的指定支撑中，并使用直镊子折断针尖。
      注意： 将玻璃针折断靠近尖端，以避免形成大孔。
    3. 在移植到切片中之前，设置显微注射参数。将 压力 设置为 10 psi。
      注意：压力值可以根据显微注射器和操作员的观察来改变：压力应足以显微注射细胞悬液，避免组织损伤。
    4. 在校准的载玻片上，用巴斯德移液管滴一滴矿物油，并将细胞悬浮液显微注射到液滴中。在油滴中获得的细胞悬浮球的直径与特定的显微注射体积相关。根据需要更改显微注射参数，以达到0.2mm的细胞悬浮球直径，用于注射4nL。
    5. 设置正确的体积后，将细胞悬液快速显微注射到切片中。在荧光体视显微镜下检查切片中是否存在细胞，以验证显微注射/移植是否成功。
      注意：细胞悬液有时可能会阻塞针头：在这种情况下，尝试通过修改注射参数来去除细胞悬液的堵塞物，或用新鲜的细胞悬液加载新的针头。
    6. 移植后，将切片置于37°C和5%CO2至所需时间点，并按照步骤2.2.7-2.2.8中所述每隔一天进行培养基更换。

7.免疫荧光染色

  1. 第1天
    1. 从插入膜底部取出培养基，并用预热的 DPBS 洗涤切片 3 次。
    2. 用预热的 4% 甲醛 （FA） 固定切片：去除 DPBS，并在膜插入物底部加入 1.5 mL 4% FA 与切片一起。在室温下孵育 15 分钟后，在膜插入物的上表面再加入 1 mL 的 4% FA，并在室温下孵育 15 分钟。 总固定时间：室温下 30 分钟
    3. 去除4%FA，用DPBS洗涤切片3 x 10分钟。
    4. 用手术刀将插入物的膜沿圆周方向切开，将带有切片的膜与插入物的塑料组件分开，然后进行免疫荧光步骤。
      注意：在此步骤之后，带有切片的膜漂浮在培养皿中的 DPBS 中。
    5. 在室温下用 1 mL/膜的 0.7% Triton 溶液在 DPBS 中透化 10 分钟。
    6. 除去透化溶液，将样品在4°C下与1mL /膜的0.5%Triton，10%FBS在DPBS中组成的封闭溶液孵育4小时。
    7. 去除封闭溶液，将一抗加入切片中，以工作稀释度，例如，小鼠抗神经丝 （NFL） 抗体，1：500;兔子反NFL，1：500;兔抗RBFOX3（NeuN）抗体，1：400;兔抗活性caspase-3（aCASP3），1：400;小鼠抗人细胞核，（胡-努），1：400;兔反胡女，1：400;小鼠抗GFP，1：400（如表1报告）在1mL抗体溶液中，该溶液由0.5%Triton，1%FBS在DPBS中组成。在4°C下孵育ON。
  2. 第2天
    1. 用 1-2 mL DPBS 洗涤膜 3 x 10 分钟。
    2. 用二抗（例如，山羊抗小鼠 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 488,1：500;山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 568,1：500;山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 647,1：500;山羊抗兔 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 647,1：500，如表 1 所示）和 Hoechst/DAPI 在 1 mL/膜抗体溶液中稀释细胞核（Triton 0.5% + FBS 1% 在 DPBS 中）在室温下稀释 3 小时。
      注意：小心保护样品免受光线照射，以避免在孵育过程中和以下步骤中出现二抗漂白。
    3. 取出抗体溶液并用 DPBS （1-2 mL） 洗涤 3 x 10 分钟。
    4. 用新的DPBS替换DPBS，并在4°C的避光条件下储存。
    5. 在免疫荧光方案结束时，将膜安装在载玻片上。将一滴 200 μL 封固液放在载玻片上。在直镊子的帮助下，将浮动膜从 35 毫米培养皿转移到盖玻片上，然后将膜与安装溶液一起转移到载玻片上。
    6. 将一滴 100 μL 封固溶液滴在新的盖玻片上，并用它覆盖膜，将其固定在载玻片上。让它在化学罩下、避光条件下干燥过夜。
    7. 将样品储存在4°C的黑暗中或进行成像分析。

8. 活/死检测

  1. 通过每培养皿新鲜培养基分装 700 μL 来制备工作溶液，并在正确的工作稀释度下加入 Sytox（例如，组分 B，1：2,000）和钙黄绿素 AM（例如，组分 A，1：2,000）。
    注意：由于试剂对光敏感，因此请保护工作溶液免受光照照。
  2. 评估膜底部的培养基体积，并以步骤8.1中描述的相同工作稀释度加入Sytox和Cal黄绿素AM。
  3. 在步骤 8.1 中制备的每片工作溶液的顶部加入 2 滴 30 μL，每滴 30 μL。
    注意： 将培养皿置于黑暗环境中，以保护培养皿免受光线照射。
  4. 在室温下孵育切片 30 分钟。
  5. 孵育后，用手术刀从插入物上切出膜：之后，带有切片的膜漂浮在工作溶液中。
  6. 借助直镊子将没有安装溶液的膜倒置在盖玻片上，然后在膜顶部加入 100 μL DPBS 以保持它们水分。
  7. 使用共聚焦显微镜尽快获取实时图像。
    注意：在图像采集过程中，每 30 分钟在膜顶部添加 2 滴 40 μL DPBS，以防止膜变干。

9. 影像学检查

  1. 固定样品的共聚焦成像
    1. 对于定性分析，使用具有以下采集参数的共聚焦显微镜采集图像：设置 大图像选项 （选择： 4 x 4），使用 10 x 物镜， 无堆栈， 分辨率 为 3,634 x 3,634 像素。
    2. 对于定量分析（aCASP3，钙黄绿素和Sytox用于切片，aCASP3用于细胞），使用具有以下采集参数的共聚焦显微镜采集图像： 20 x物镜，分辨率 为 1,024 x 1,024像素 ， Z步长 为 3μm。
  2. 使用体视显微镜对移植切片进行实时成像
    注意： 使用立体显微镜在明场和落射荧光模式下捕获图像。
    1. 使用 明场 设置，采集切片的图像（1 x 物镜 ，此处使用 3 倍变焦 ）。
      注意：根据所使用的显微镜修改光线，并在必要时使用光纤。
    2. 使用 荧光 设置，使用与切片相同的物镜和缩放获取移植细胞的图像（参见步骤9.2.1）。使用以下参数进行采集： 增益 1，曝光 200-500 毫秒，偏移 -10。
  3. 使用共聚焦显微镜进行活/死测定后的实时成像
    1. 使用具有以下采集参数的共聚焦显微镜采集图像： 20倍物镜，分辨率1,024 x 1,024像素 ， Z步长 为 3μm。

10. 通过ImageJ进行图像分析

  1. NFL、RBFOX3 和 DAPI 面积分析
    1. 打开 ImageJ 软件 （https://imagej.net/software/imagej/）。
    2. 通过单击 “文件”|“打开”|选择“文件”|“打开”来打开文件图像。
    3. 在弹出的窗口中，选择堆栈查看 |Hyperstack 和颜色模式 |默认值（具有自动缩放功能）。
    4. 在工具栏中，选择 “图像”|”颜色 |拆分频道。
    5. 选择要分析的所需通道：NFL 的绿色通道（轴突标记物）、RBFOX 3 的红色通道（神经元标记物）和 DAPI（核染色）的蓝色通道。
    6. 对于 NFL 分析，请继续执行以下步骤：在工具栏中选择图像 |调整 |阈值 | 选择 参数 （深色背景、算法，例如默认值）并在值条上移动光标（下方/上方）以覆盖和外界所有神经突区域（神经突在深色背景中以白色高亮显示） | 套装 |申请。
    7. 从工具栏中选择 描摹工具 Wand 并使用它来自动定义 NFL 覆盖的白色区域。新闻 分析 |测量 |面积值，单位为μm 2。
    8. 对于 DAPI 和 RBFOX3 分析，请继续执行以下步骤：在工具栏中，选择“图像”|”调整 |阈值 |选择参数（白色背景、算法，例如默认值）并在值条上移动光标（下方/上方）以覆盖和限制所有 RBFOX3 或 DAPI 区域 |套装 |申请。
    9. 在工具栏中，选择“ 处理”|”傅里叶变换 |带通滤光片。 使用 阈值条 调整 RBFOX3 或 DAPI 覆盖的白色区域，对应于它们的荧光信号。
    10. 从工具栏中，选择 描摹工具 Wand 并使用它来自动定义 RBFOX3 或 DAPI 覆盖的区域。新闻 分析 |测量 |面积值，单位为μm 2。
  2. 通过ImageJ分析细胞凋亡
    1. 打开 ImageJ 软件 （https://imagej.net/software/imagej/）。
    2. 单击 “文件”|“打开”|选择“文件”|“打开”，打开 Z-stack 文件图像。
    3. 在弹出的窗口中，选择堆栈查看 |Hyperstack 和颜色模式 |默认值（具有自动缩放功能）。
    4. 在工具栏中，选择 “图像”|”颜色 |拆分频道。
    5. 选择所需的通道：红色通道用于 aCASP3（要分析的细胞凋亡标记物），蓝色或青色通道用于 DAPI 或 胡-Nu 用于细胞核。然后，通过在工具栏中选择“图像”|”颜色 |合并频道 |创建复合。
    6. 拖动图像底部的 Z 条以浏览图像的 Z 堆栈，并识别切片中心区域中具有 aCASP3 阳性的堆栈。
    7. 在工具栏中，选择 Plugins |分析 |细胞计数器。
    8. 在打开的弹窗中，选择 “初始化” ，为计数准备镜像;然后，选择 计数器类型 （例如，Type 1） 并将其重命名为要计数的对象（例如，aCASP3+ 细胞）。如上所述重命名其他计数器类型以对其他对象进行计数（例如，DAPI+ 或 胡-Nu+ 单元格表示单元格总数）。
    9. 在弹出的窗口中，选择与要计数的对象对应的计数器类型（例如，aCASP3+ 细胞），然后选择工具栏中的 点工具 ，并开始手动计算凋亡细胞的数量，aCASP3 为阳性，单击打开的图像中的每个阳性细胞。
    10. 在细胞计数器窗口中选择另一种计数器类型，并开始计算细胞总数（DAPI+ 细胞，用于切片;胡-Nu+ 细胞，用于移植细胞）。
  3. 通过 ImageJ 分析活/死检测
    1. 打开 ImageJ 软件 （https://imagej.net/software/imagej/）。
    2. 单击 “文件”|“打开”|“选择文件”|“打开”来打开 Z-stack 文件图像。
    3. 在弹出的窗口中，选择堆栈查看 |Hyperstack 和颜色模式 |默认值（具有自动缩放功能）。
    4. 在工具栏中，选择“ 图像”|”颜色 |拆分频道。
    5. 选择所需的通道：钙黄绿素（要分析的活力标记物）的绿色通道和 Sytox（死亡标记物）的青色通道。然后，通过在工具栏中选择“图像”|”颜色 |合并频道 |选择“创建复合”。
    6. 拖动图像底部的 Z 条以浏览图像的 Z 堆栈，并识别切片中心区域中具有钙黄绿素和 Sytox 阳性的堆栈。
    7. 在工具栏中，选择 Plugins |分析 |细胞计数器。
    8. 在打开的弹窗中，选择 “初始化” ，为计数准备镜像;然后选择 计数器类型 （例如，Type 1） 并将其重命名为要计数的对象（例如，Calcein+ 细胞）。如果需要对另一个对象（例如，Sytox + 细胞）进行计数，请重命名上述其他计数器类型。
    9. 在弹出的窗口中，选择要计数的对象对应的计数器类型;然后选择工具栏中的 “点”工具 ，并开始手动计算Cal黄绿素+ 单元格的数量，单击打开的图像中的每个阳性单元格。
    10. 在细胞计数器窗口中选择另一种计数器类型，并按照钙黄绿素的说明对 Sytox+ 细胞进行计数。

11. 图表和统计分析

  1. 使用所选软件执行所有统计分析并绘制图表。

Representative Results

所描述的方法允许在P3阶段建立小鼠的SC器官型切片，并在健康条件下将其长时间维持在培养物中。此外，我们还展示了将细胞移植到切片中并共同培养它们长达 30 天的方案（图 1）。首先，我们展示了培养条件的优化和适用于用移植细胞长时间培养SC切片的方案（图2A）。在OM中，从DEV 0到DEV 2生成并维持切片，OM最初被提议作为维持SC切片47的最佳介质。然而，由于血清蛋白的存在，该培养基可能无法维持移植的神经前体细胞的神经元分化和成熟。事实上，在 DEV 3 中，我们测试了从 OM 到 GM 的转换，这是一种含有 Neurobasal 加 B27 的配方，它支持神经存活，并且不含血清，它会抑制正确的神经元分化，反而促进神经胶质命运48,49。

图2B显示了将DEV 3的培养基从OM切换到GM所获得的结果，与未接收到开关的SC切片（对照切片在OM中培养）相比。我们使用切片内NFL信号的分布作为神经元完整性的标志（图2B，C）。DEV 7 的切片在两种培养条件下都是健康的，显示出它们内部神经丝（NFL，绿色）的弥散分布。在 DEV 10 中，与在 OM 中培养的对照切片相比，在 GM 中培养的切片似乎更健康，正如 NFL 染色分布所记录的那样。我们还估计了图2B的代表性图像中显示的切片的NFL+面积（% NFL+面积/DAPI+面积）。估计的 NFL+ 面积在图 2C 的直方图中表示，证实了在两种条件下，NFL 信号在 DEV 7 处的切片中扩散分布。然而，在 DEV 10 时，对于 OM 培养条件，NFL 染色覆盖的估计面积会减少。

这些数据表明，在 DEV 3 时切换到 GM 对于 SC 切片的长时间培养 （DEV 10） 具有良好的耐受性。下一步，我们在更长的时间点测试了 GM：DEV 30、DEV 60 和 DEV 90。如图 3A，B 所示，切片在培养物中保持健康，直到 DEV 90。在每个时间点的切片中都发现 NFL 染色广泛存在，从中心区域出发的神经突切片周围有弥漫性发芽。事实上，我们估计了图3A所示切片的NFL+面积，并且随着时间的推移而增加，如图3B的直方图所示。我们还观察到神经元标记物RBFOX3的阳性，为切片的神经元分化提供了另一条证据。在每个时间点，我们还通过评估不同切片中对aCASP3阳性的细胞数量来检查凋亡率（图4A，B）。分析按照协议第 10.2 节中的描述进行。发现每个时间点的凋亡率（% aCASP3+ 细胞/DAPI+ 细胞总数）非常低（DEV 30、60 和 90 ± 分别为 0.85 ± 0.52%、0.71 0.27%、0.66 ± 0.45%），三个考虑的时间点之间没有显着差异（p 值 > 0.05，图 4B）。这些数据表明，与 aCASP3 相关的凋亡率在一段时间内保持稳定，并且与切片中 NFL 的广泛分布（图 4A）一起证实了切片在每个时间点的存活。

为了支持之前的数据，我们还进行了活/死测定，以评估切片在三个不同时间点的活力。我们使用钙黄绿素（绿色染色）来标记活细胞和代谢活性细胞，并使用 Sytox（青色染色）来评估细胞死亡。 如图 4C 中的直方图所示，从 DEV 30 到 DEV 90，代谢活性细胞的百分比略有增加（DEV 30、60 和 90 分别为 93.17 ± 5.21%、96.43 ± 3.02%、96.33 ± 3.10%），在最后两个时间点之间保持稳定（DEV 30 vs DEV 60 p 值 = 0.018;DEV 30 与 DEV 90 p 值 = 0.027;DEV 60 与 DEV 90 p 值 = 0.99）。我们发现随着时间的推移，细胞死亡水平较低（DEV 30、60 和 90 分别为 6.83 ± 5.21%、3.57 ± 3.02%、3.66 ± 3.10%），并且发现 DEV 30 和以后的时间点 DEV 60 和 DEV 90 之间存在显着差异（DEV 30 vs DEV 60 p 值 = 0.018;DEV 30 与 DEV 90 p 值 = 0.027;DEV 60 与 DEV 90 p 值 = 0.99）。这些数据与细胞凋亡率相关联，证实了切片随时间推移的存活率，并支持所执行的长期培养方案的有效性。

一旦确定了 SC 切片长时间培养的可行性，我们就通过在神经元分化的第一阶段移植 h-SC-NES 细胞来挑战该系统。我们测试了 h-SC-NES 细胞，因为它们在 SCI 治疗12 中显示出有希望的结果。将h-SC-NES细胞移植到小鼠SC切片中的程序在方案第6节中描述。SC 切片和移植的 h-SC-NES 细胞维持至 DPT 30。在分化的 DIV 10（神经前体阶段）将细胞移植到 DEV 4 器官型切片中，如图 5A 的方案方案所示。监测移植细胞在培养物中 GFP 的表达长达 30 天。 图5B 显示了在不同DPT下移植GFP+ 细胞的SC切片的代表性实时图像。GFP随时间推移的稳定表达（图5B 和 图6A）表明，在先前优化的培养条件下，细胞存活到SC组织中。我们还检查了移植细胞的凋亡率，如方案第10.2节所述。发现30 DPT后凋亡率（% aCASP3 + 细胞/胡-Nu + 细胞总数）非常低（0.44±0.34%）（图6B）。此外，发现 DPT 30 时的凋亡率与 DPT 7 时相同类型细胞的凋亡率一致，如先前报道的40 所示，表明培养物随着时间的推移而稳定。

figure-representative results-3351
图 1：协议的工作流程。 代表性方案，显示了所执行协议的一般工作流程。（A） 左图，总结了小鼠幼崽在 P3 处分离的 SC 产生小鼠 SC 切片和 SC 器官型切片的长期培养的方案。（B） 右边是总结将表达 GFP 的 h-SC-NES 细胞移植到小鼠 SC 器官型切片中的方案。移植细胞在移植后维持 30 天。缩写：h-SC-NES=人脊髓来源的神经上皮茎;GFP = 绿色荧光蛋白;DEV = 离体日;DPT = 移植后第二天;NFL = 神经丝轻链;RBFOX3= RNA 结合 fox-1 同源物 3;aCASP3 = 活性 Caspase-3;SC=脊髓。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图2：长期培养条件的优化。 （A） 测试OM和GM的协议的代表性方案。 对照组的OM维持至DEV 7-10。在DEV 3时将培养基切换到GM以处理过的切片;然后，将它们固定在 DEV 7-10 上，以便与对照进行比较。（B） 比较在不同条件下培养的 DEV 7 和 10 的小鼠 SC 器官型切片的代表性图像。对切片进行细胞骨架标记物神经丝（NFL，绿色）染色。用转基因培养的切片中 NFL 染色的广泛分布表明总体存活率和分化。细胞核用DAPI复染。比例尺 = 500 μm。 （C） 图 1B 所示切片中 NFL 覆盖面积估计值的代表性直方图。在 DEV 10 时，在 OM 培养条件下，NFL 表面积减小。缩写：DEV = day ex vivo;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;NFL = 神经丝轻链。;OM = 器官型培养基;GM = 移植培养基;SC = 脊髓。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 3：长期培养的小鼠 SC 器官型切片。 （A） 切片在培养物中保持至 DEV 90。免疫荧光测定显示细胞骨架标记物神经丝（NFL，绿色）和核神经元标记物 RBFOX3（红色）分布广泛，证明了它们在长期培养后的健康状况和神经元身份。值得注意的是，随着时间的推移，NFL+ 轴突会在切片周围弥漫性地发芽。细胞核用DAPI复染。比例尺 = 500 μm。 （B） 图 A 中显示的 NFL+ 面积和时间估计值以及 RBFOX3+ 面积估计值的代表性直方图 。 NFL+ 神经突面积随着时间的推移而增加。缩写：DEV = day ex vivo;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;NFL = 神经丝轻链;SC = 脊髓;RBFOX3= RNA 结合 fox-1 同源物 3。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 4：SC 切片中细胞活力随时间的评估。 （A） DEV 60 处的 aCASP3（红色）和 NFL（绿色）染色的器官型切片的代表性图像。比例尺 = 100 μm。 NFL 显示漫反射图案。稀有细胞的凋亡标志物 aCASP3 呈阳性（插图：1-2-3）。（B）不同时间点切片凋亡率分析。平均 ± SD，N（重复）= 6 个切片，n（总细胞数）>每个切片 1,000，Kruskal-Wallis 检验，多重比较，p 值 > 0.05。凋亡率随时间推移保持稳定。在图 A 的插图 1-2-3 中，可以观察到 aCASP3 阳性细胞的细节（红色染色，白色箭头）。小红点标记细胞碎片和脓结核。比例尺 = 50 μm。 （C） 在 DEV 90 时对 SC 切片进行的活/死测定的代表性图像：代谢活性细胞用钙黄绿素标记为绿色，而死亡和受损细胞用 Sytox 标记浅蓝色（青色）。两个直方图显示了钙黄绿素（左侧）和 Sytox（右侧）阳性的细胞占细胞总数的百分比。对于均值± SD，N（重复）= 6 个切片，n（总细胞数）>每个切片 1,000，Kruskal-Wallis 检验，多重比较， DEV 30 vs DEV 60 p 值 = 0.018;DEV 30 与 DEV 90 p 值 = 0.027;DEV 60 与 DEV 90 p 值 > 0.99。缩写：DEV = day ex vivo;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;NFL = 神经丝轻链;SC = 脊髓;aCASP3 = 活性半胱天冬酶-3。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 5：将 h-SC-NES 细胞移植到小鼠器官型切片中。 （A） 移植方案的代表性方案。细胞在分化的 DIV 10 时作为神经前体移植到 DEV 4 器官型切片中。（B） 移植用表达 GFP 的 h-SC-NES 细胞移植的小鼠器官型切片的代表性图像，直至 DPT 30。用携带 GFP 基因的慢病毒载体转导细胞。GFP随时间推移的表达证实了它们的活力和对切片环境的适应性。比例尺 = 500 μm。缩写：DIV = 分化前的第一天;h-SC-NES = 人脊髓来源的神经上皮茎;GFP = 绿色荧光蛋白;DEV = 离体日;OM = 器官型培养基;GM = 移植培养基;DPT = 移植后天数。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 6：移植后 30 天后移植的 h-SC-NES 细胞的凋亡率评估。 （A） 移植有表达 GFP 的 h-SC-NES 细胞的小鼠器官型切片的代表性图像。用携带 GFP 基因的慢病毒载体转导细胞，以便在移植后监测它们进入切片。GFP随时间推移的表达证实了它们的活力和对切片环境的适应性。显示的时间点为 DPT 30;对细胞进行人核（青色）和 aCASP3（红色）染色。比例尺 = 150 μm。 （B） 左侧是 DPT 30 时移植成片的细胞凋亡分析的代表性饼图（N（重复）= 5 个切片，n （细胞） = 5,000），右侧是 胡-Nu+ 细胞的插图和对 aCASP3 呈阳性的细胞的详细信息（白色箭头）。比例尺 = 75 μm。小红点标记细胞碎片和脓结核。缩写：h-SC-NES=人脊髓来源的神经上皮茎;GFP = 绿色荧光蛋白;DPT = 移植后第二天;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;NFL = 神经丝轻链;aCASP3 = 活性半胱天冬酶-3;胡-努 = 人类细胞核。 请点击这里查看此图的较大版本.

表1：本协议中使用的溶液组成。请按此下载此表格。

Discussion

对于SCI患者，目前还没有有效的治疗方法。 已经测试了不同的方法，其中最有希望的方法之一是基于再生策略 - 细胞替换。目前，再生医学领域的进步要求人们提供新的平台来测试细胞移植的疗效和安全性，无论是单独使用还是与其他方法结合使用。他们的临床前验证对于进行进一步的临床研究至关重要。SC 器官型培养是研究神经退行性疾病、神经再生和神经发育不同方面以及研究新型治疗方法有效性的有用平台23。特别是，器官型培养物的特定特征（例如维持原始组织结构以及细胞和微环境组成）有利于揭示移植动力学（例如细胞植入、整合、分化和成熟）。

与已发表的方案一致，SC器官型切片可以在健康条件下在培养物中维持约2-3周，这限制了它们用于测试细胞治疗方案所需的长期研究和功能筛选。探索分化和成熟等重要过程，以确定 SC 组织内移植细胞的正确命运，需要长期监测。在动物模型的常见移植过程中，这些细胞过程至关重要。在临床前筛选阶段，模拟体内存在的许多特征的离体系统的可用性将有所帮助。

出于这个原因，在这项工作中，我们提出了一种最佳的长期（≥30 天）SC 器官型培养方法，该方法允许将活的 SC 切片维持长达 90 天，是其通常培养时间框架的三倍。此外，我们展示了稳定的 h-SC-NES 细胞在 SC 切片内植入，并且移植培养物可维持长达 30 天。我们通过观察 GFP 表达来监测细胞植入随时间的变化，以验证细胞存活率高达 DPT 30。30 DPT 后，我们评估细胞凋亡率。在文献中，已报道在 7 DPT 下 SC 切片中移植的 h-SC-NES 细胞凋亡的评估40。在这里，我们扩展了 DPT 30 的细胞凋亡分析，以比较相对于早期时间点 （DPT 7） 的凋亡率。我们发现我们的数据与文献一致，表明移植的 h-SC-NES 细胞如果保持在我们工作中优化的培养条件下，它们也会在以后的时间点存活。这种改进的长期 离体 平台单独使用和移植配置将帮助研究人员进行基于干细胞的SCI移植的临床前筛选。这将使他们能够确定最佳的细胞候选者，用于进一步的 体内 研究，促进移植的成功。此外，在初步筛选后，SC器官型切片也可以与 体内 研究并行使用，以确认和证实在动物模型中观察到的长期细胞动力学和行为，或支持机制研究。

我们的协议详细描述了如何生成这种长期器官型模型，但也应讨论一些关键步骤。关于SC器官型培养物的生成，在手术和培养的第一阶段存在一些挑战。执行良好的手术程序对于生成保持原始组织结构的切片至关重要。如果 SC 在分离过程中被破坏，切片可能会失去其典型的解剖结构，组织损伤会诱发过度的促炎损伤，从而导致不健康的状况和细胞死亡。手术中最具挑战性的阶段是从脊柱中取出皮下细胞瘤，并从孤立的皮下皮带中切除脑膜。这些步骤的成功取决于操作者的经验;因此，建议在开始实验之前进行一段时间的训练。

通过斩波器对 SC 进行冠状切片也是一个具有挑战性的阶段。隔离的 SC 应放置在完全垂直于刀片的切割台上。操作员还应将刀片垂直于切割台放置。这些预防措施对于确保在相同和不同实验之间产生可重复的切片是必要的。另一个重要问题是手术时间有限：整个切片生成过程必须需要 ~30 分钟。如果操作者在手术和切割上花费更多时间，SC组织将受到影响，这可能会影响培养的成功和实验的后续步骤。

一旦将切片放在培养膜上，正确喂养它们就很重要。GDNF 是维持组织恢复和存活所必需的。用切碎器切割对组织是创伤性的，因此，在切割后不久将切片放入冰冷的解剖培养基中，以清除多余的促炎和促死亡分子。然后，将切片用用 GDNF 改性的新鲜培养基放置在培养膜（细胞培养插入物）上，以促进更快的恢复和切片与膜的粘附。由于GDNF的半衰期短，因此在培养的第一周内应每天将GDNF添加到培养基中50,51。我们观察到，切片在培养的第一天需要持续存在 GDNF，以促进组织恢复和活力。无论如何，由于GDNF的存在对整个培养期都很重要，因此强烈建议不要在以后的时间点中断GDNF给药。

在培养的第一周，通过肉眼和显微镜观察切片也很重要。半透明的组织和边界的透明度是切片与膜和活组织正确粘附的标志。乍一看，坏死组织会呈现出极白的白色，而坏死区域在显微镜下会呈现深灰色。培养几周后，组织的形态可能会发生变化：细胞运动和组织与膜的粘附会影响这一过程。例如，我们观察到一些充满细胞的切片中中央管腔的丧失以及背角和腹角形态的丧失。这主要发生在较小的切片上，而其中大多数切片将保持接近原始切片的解剖结构。切片通常是从腰椎或胸部区域产生的，因为通过这种方式，它们可以具有适当的大小以随着时间的推移保持其原始的组织结构：如果它们太小，它们会失去结构，而如果太大，中心区域可能会坏死。因此，我们使用小鼠幼崽的腰部区域来生成具有适当大小的切片，以实现最佳的长期培养，但原则上，可以考虑其他部分。此外，我们选择使用腰部区域，因为腹侧和背侧区域彼此之间更容易区分。此外，该区域呈现出运动神经元和灰质比例较高的组织区域，这些是 SCI 中细胞替代疗法的感兴趣位点。 关于将细胞移植到切片中，主要问题与玻璃微针尖端的破裂有关。如果细胞传入的孔太大，则在显微注射过程中可能会对SC组织造成损伤。如果它太小，细胞堆积会阻塞针头，从而阻碍移植过程。移植程序应在 1 小时内完成，以尽量减少细胞痛苦和死亡。

所提出的方案为不同类型的调查提供了一种最佳和通用的工具。在这里，我们应用我们的长期平台来验证 h-SC-NES 细胞在小鼠 SC 组织内分化的第一阶段移植 30 天。所提方法的主要新颖性是共培养方案的优化。GM 的成分维持 SC 切片和移植的 h-SC-NES 细胞的长期神经元存活。事实上，转基因作为一种无血清培养基，与以前用于器官型切片培养的培养基相比，它维持了移植细胞向神经元命运的分化47。

关于所提出的SCI模型，通常在成年小鼠上进行实验。到目前为止，新生儿和成人 SC 之间最重要的差异与新生儿相对于成年小鼠发现的更高的再生潜力有关52。然而，这种差异对我们提出的协议类型没有影响，因为在这里我们关注的是移植细胞对宿主组织环境的反应，而不是对驻留神经元的再生能力的反应。SCI后新生小鼠和成年小鼠之间的另一个差异与成人中发生的神经胶质瘢痕的形成有关。所提出的模型没有考虑到这一方面，该模型没有考虑由原发性和继发性损伤引起的复杂生理病理过程。

关于应用，该平台还可用于研究移植细胞与SC器官型模型中存在的驻留电路之间的整合。基因工程工具已经在中枢神经系统中用于评估突触连接，并且可以在这方面加以利用53,54,55。特别是，可以通过评估移植细胞和 SC 离体组织之间突触的形成来研究和验证整合。这些长期器官型培养物也可用于检测神经保护剂和神经再生剂或新型分子/材料，或研究涉及 SC 的神经退行性疾病。为了研究特定的神经退行性疾病，该方案需要适应在病理学的相关阶段（即新生儿、青少年、成人）培养由相关模型生成的SC切片，例如携带特定病理学相关突变的转基因小鼠。总之，我们的方案和一般的器官型培养物，作为特定器官的外植体，具有弥合 2D 细胞培养物和体内模型之间差距的特征，证实了它们是基础研究和临床前测试的宝贵工具。

Disclosures

提交人无需声明任何利益冲突。

Acknowledgements

该研究得到了生命之翼基金会 （WFL-IT-20/21）、欧盟下一代欧盟-国家恢复和复原力计划 （NRRP）-任务 4 第 2 部分、投资 n.1.4-CUP N.B83C22003930001（托斯卡纳健康生态系统-THE，辐条 8）和 Marina Romoli Onlus 的支持。本手稿仅反映作者的观点和意见，欧盟和欧盟委员会均不能被视为对此负责。数据和元数据可在 Zenodo 10.5281/zenodo 上找到。10433147.图像是使用 Biorender https://www.biorender.com/ 生成的。

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-cleaved Caspase-3,  (Asp175) (5A1E) (Rabbit)Cell Signaling Technology9661S1:400
anti-GFP (Mouse) - monoclonalSigma/MerckG65391:400
anti-Human Nuclei (Mouse) - monoclonal, clone 235-1 Sigma/MerckMAB12811:400
anti-Human Nuclei (Rabbit)NeoBiotechnologiesRBM5-346-P11:400
anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) - polyclonalSigma/MerckABN781:400
anti-NFL (Mouse)Sigma/MerckMAB16151:400
anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonalBiologend8408011:500
Aqua PolymountPoly-sciences18606-20
B-27Gibco17504-044
BDNFGibcoPHC7074
BladesLeica118364227
Cell culture graded waterSigma/MerckW3500-500ML
Collagen from rat tailSigma/MerckC7661
Confocal microscope - A1 Confocal Microscope (Eclipse Ti)Nikon 
D(+)-GlucoseSigma/MerckG7021
Dissecting ForcepsWorld Precision Instruments15915
DMEM/F12Gibco31330
DPBSSigma/MerckD8537
EGFSigma/Merckgf144
FBSGibco10270-106
FGF-2Stemgent03-0002
GDNFSigma/MerckSRP3200
Glass capillaries, 3.5" Drummond Scientific Company3-000-203-G/X
GlutamaxGibco35050-038
Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11029
Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA212361:500
Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA110111:500
Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA212441:500
Graph Pad-PrismDotmaticsSoftware for Statistical Analysis
HBSSGibco14025-0501:500
HEPESGibco15630-056
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Horse SerumGibco16050-122
InsulinSigma/MerckI9278
LamininSigma/MerckL2020
Lentiviral prepAddgene17446-LV
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030024
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kitThermo Fisher ScientificL32250
McIlwain Tissue ChopperWorld Precision Instruments
MEMGibco11090-081
Microloader tipsEppendorf5242956003to load cells in the needle for transplantation
Microscope slidesVWR631-0909
Millicell cell culture membraneSigma/MerckPICM0RG50
Miscroscope cover glassesVWR ECN 631-1572
N-2Gibco17502-048
NeurobasalGibco21103-049
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Petri dish (35mm)VWR734-2317
PFASigma/MerckP6148-500G
Plastic pasteur pipetteSarstedt86.1171.010
Pneumatic PicoPumpWorld Precision InstrumentsPV830Microinjector for transplantation
Poly-L-lysineSigma/MerckP4707
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless SteelVWR InternationalSWAN3001
Scalpel handle #3World Precision Instruments500236
Spring ScissorsWorld Precision Instruments501235
Stereomicroscope for imaging and acquisitionNikon SMZ18
Stereomicroscope for surgeryVWR
Triton X-100MerckT8787
Tweezers-Dumont #5-inoxWorld Precision Instruments501985
Vannas Scissors, 8.5 cmWorld Precision Instruments500086
Vertical micropipette pullerShutter InstrumentP-30
Y-27632R&D Systems1254/50

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