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Este protocolo descreve o isolamento de progenitores fibroadipogênicos (FAPs) do músculo esquelético e cardíaco de camundongos espinhosos (Acomys) por meio de dissociação enzimática e classificação de células ativadas por fluorescência. As FAPs obtidas a partir deste protocolo podem ser efetivamente expandidas e diferenciadas para miofibroblastos e adipócitos.
Devido ao seu programa de reparo excepcional, o rato espinhoso é um modelo de pesquisa emergente para a medicina regenerativa. Os progenitores fibroadipogênicos são células residentes no tecido que são capazes de se diferenciar em adipócitos, fibroblastos e condrócitos. Os progenitores fibroadipogênicos são fundamentais para orquestrar a regeneração tecidual, pois são responsáveis pela remodelação da matriz extracelular após a lesão. Este estudo se concentra em investigar o papel específico dos progenitores fibroadipogênicos no reparo cardíaco de camundongos espinhosos e na regeneração do músculo esquelético. Para este fim, um protocolo foi otimizado para a purificação de progenitores fibroadipogênicos de camundongos espinhosos por citometria de fluxo do músculo esquelético e cardíaco enzimaticamente dissociado. A população obtida a partir deste protocolo é capaz de se expandir in vitro, podendo ser diferenciada em miofibroblastos e adipócitos. Este protocolo oferece uma ferramenta valiosa para os pesquisadores examinarem as propriedades distintas do rato espinhoso e compará-las com o Mus musculus. Isso fornecerá insights que podem avançar na compreensão dos mecanismos regenerativos neste modelo intrigante.
Inicialmente reconhecido por sua pele excepcionalmente frágil e notável capacidade de reparar lesões cutâneas, o camundongo espinhoso demonstrou capacidade regenerativa superior em vários sistemas orgânicos, como musculoesquelético, renal, sistema nervoso central e cardiovascular, quando comparado ao Mus musculus 1,2.
Os progenitores fibroadipogênicos (FAPs) são um subconjunto de células estromais que residem em vários tecidos, incluindo o músculo esquelético e cardíaco. Essas células possuem uma capacidade única de se comprometer com linha....
Todos os procedimentos experimentais e de manutenção animal foram conduzidos de acordo com a aprovação do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade da Colúmbia Britânica e os regulamentos da Universidade da Colúmbia Britânica. Os animais foram alojados em uma instalação fechada livre de patógenos sob condições padrão (ciclo claro-escuro 12:12, 21-23 ° C e nível de umidade de 40% a 60%) e forneceram uma dieta rica em proteínas e água ad libitum. Camund.......
O esquema para este protocolo de isolamento e cultura de FAPs do músculo esquelético e cardíaco está resumido na Figura 1. Para a coleta de tecidos, a mudança de cor do fígado de vermelho escuro para amarelo pálido geralmente é indicativa de uma perfusão bem-sucedida. Com as faixas etárias especificadas do camundongo espinhoso, os pesos do coração são normalmente em torno de 200 mg, enquanto o músculo quadríceps é de cerca de 350 mg.
Os tecidos espinhosos de camundongos são mais sensíveis às tensões na dissociação do tecido, e existem vários aspectos desse protocolo que visam minimizar o estresse para melhorar a viabilidade celular. A técnica de dissociação enzimática serial é empregada para a preparação de amostras para diminuir a concentração da enzima necessária. À medida que a digestão enzimática prossegue, a atividade enzimática diminui. Ao substituí-lo por enzimas frescas, a atividade enzi.......
Gostaríamos de agradecer a Andy Johnson e Justin Wong, núcleo de fluxo da UBC, por sua experiência e ajuda na otimização do protocolo FACS, bem como à equipe das instalações de animais do UBC Biomedical Research Center para cuidados com camundongos espinhosos. A Figura 1 foi feita usando Biorender. A Figura 2 foi feita usando o software FlowJo.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5M EDTA | Invitrogen | 15575–038 | |
1.7 mL Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
20 mL syringe | BD | 309661 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
48 well flat-bottom tissue culture plate | Falcon | 53078 | |
5 mL polypropylene | Falcon | 352063 | |
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
5 mL syringe | BD | 309646 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
60 mm Petri dish | Falcon | 353002 | |
96 well V-bottom tissue culture plate | Corning | 3894 | |
Acomys dimidiatus mice (spiny mice) | kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky). | ||
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
Anti-perilipin (1:100) | Sigma | P1873 | |
Anti-SMA (1:100) | Invitrogen | 14-9760-82 | |
APC PDGFRa (1:800) | Abcam | ab270085 | |
BD PrecisionGlide Needle 18 G | BD | 305195 | |
BD PrecisionGlide Needle 23 G | BD | 305145 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906-100g | |
BV605 CD31 (1:500) | BD biosciences | 744359 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000) | Invitrogen | A31570 | |
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000) | Invitrogen | A31573 | |
Donkey serum | Sigma | S30-100ML | |
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers | Beckman coulter | B52102 | |
Fetal bovine serum | Gemini | 100-500 | |
Fine scissors | FST | 14058-11 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Forceps | FST | 11051-10 | |
Hemostat | FST | 91308-12 | |
human FGF-basic recombinant protein (bFGF) | Gibco | 13256029 | |
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1) | eBiosciences | 14-8348-62 | |
Incubator - Heracell 160i CO2 | ThermoFisher | 51033557 | |
Inverted microscope - Revolve | ECHO | n/a | |
Liberase | Roche | 5401127001 | |
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement | STEMCELL technologies | 5507 | |
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P1648-500g | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140–122 | |
PicoLab Mouse Diet 20 | LabDiet | 3005750-220 | |
Propidium iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
Transport vial 5mL tube | Caplugs Evergreen | 222-3005-080 | |
Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 |
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