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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve o isolamento de progenitores fibroadipogênicos (FAPs) do músculo esquelético e cardíaco de camundongos espinhosos (Acomys) por meio de dissociação enzimática e classificação de células ativadas por fluorescência. As FAPs obtidas a partir deste protocolo podem ser efetivamente expandidas e diferenciadas para miofibroblastos e adipócitos.

Abstract

Devido ao seu programa de reparo excepcional, o rato espinhoso é um modelo de pesquisa emergente para a medicina regenerativa. Os progenitores fibroadipogênicos são células residentes no tecido que são capazes de se diferenciar em adipócitos, fibroblastos e condrócitos. Os progenitores fibroadipogênicos são fundamentais para orquestrar a regeneração tecidual, pois são responsáveis pela remodelação da matriz extracelular após a lesão. Este estudo se concentra em investigar o papel específico dos progenitores fibroadipogênicos no reparo cardíaco de camundongos espinhosos e na regeneração do músculo esquelético. Para este fim, um protocolo foi otimizado para a purificação de progenitores fibroadipogênicos de camundongos espinhosos por citometria de fluxo do músculo esquelético e cardíaco enzimaticamente dissociado. A população obtida a partir deste protocolo é capaz de se expandir in vitro, podendo ser diferenciada em miofibroblastos e adipócitos. Este protocolo oferece uma ferramenta valiosa para os pesquisadores examinarem as propriedades distintas do rato espinhoso e compará-las com o Mus musculus. Isso fornecerá insights que podem avançar na compreensão dos mecanismos regenerativos neste modelo intrigante.

Introduction

Inicialmente reconhecido por sua pele excepcionalmente frágil e notável capacidade de reparar lesões cutâneas, o camundongo espinhoso demonstrou capacidade regenerativa superior em vários sistemas orgânicos, como musculoesquelético, renal, sistema nervoso central e cardiovascular, quando comparado ao Mus musculus 1,2.

Os progenitores fibroadipogênicos (FAPs) são um subconjunto de células estromais que residem em vários tecidos, incluindo o músculo esquelético e cardíaco. Essas células possuem uma capacidade única de se comprometer com linha....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais e de manutenção animal foram conduzidos de acordo com a aprovação do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade da Colúmbia Britânica e os regulamentos da Universidade da Colúmbia Britânica. Os animais foram alojados em uma instalação fechada livre de patógenos sob condições padrão (ciclo claro-escuro 12:12, 21-23 ° C e nível de umidade de 40% a 60%) e forneceram uma dieta rica em proteínas e água ad libitum. Camund.......

Representative Results

O esquema para este protocolo de isolamento e cultura de FAPs do músculo esquelético e cardíaco está resumido na Figura 1. Para a coleta de tecidos, a mudança de cor do fígado de vermelho escuro para amarelo pálido geralmente é indicativa de uma perfusão bem-sucedida. Com as faixas etárias especificadas do camundongo espinhoso, os pesos do coração são normalmente em torno de 200 mg, enquanto o músculo quadríceps é de cerca de 350 mg.

Discussion

Os tecidos espinhosos de camundongos são mais sensíveis às tensões na dissociação do tecido, e existem vários aspectos desse protocolo que visam minimizar o estresse para melhorar a viabilidade celular. A técnica de dissociação enzimática serial é empregada para a preparação de amostras para diminuir a concentração da enzima necessária. À medida que a digestão enzimática prossegue, a atividade enzimática diminui. Ao substituí-lo por enzimas frescas, a atividade enzi.......

Disclosures

Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Andy Johnson e Justin Wong, núcleo de fluxo da UBC, por sua experiência e ajuda na otimização do protocolo FACS, bem como à equipe das instalações de animais do UBC Biomedical Research Center para cuidados com camundongos espinhosos. A Figura 1 foi feita usando Biorender. A Figura 2 foi feita usando o software FlowJo.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTAInvitrogen15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubesVWR87003-294
15 mL centrifuge tubeFalcon352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-144
20 mL syringeBD309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)InvitrogenD3571
40 μm cell strainerFalcon352340
48 well flat-bottom tissue culture plateFalcon53078
5 mL polypropyleneFalcon352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer capFalcon352235
5 mL syringeBD309646
50 mL centrifuge tubeFalcon352070
60 mm Petri dishFalcon353002
96 well V-bottom tissue culture plateCorning3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing bufferGibcoA10492-01
Anti-perilipin (1:100)SigmaP1873
Anti-SMA (1:100)Invitrogen14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)Abcamab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 GBD305195
BD PrecisionGlide Needle 23 GBD305145
Bovine serum albuminSigmaA7906-100g
BV605 CD31 (1:500)BD biosciences744359
CaCl2Sigma-AldrichC4901
CentrifugeEppendorf5810R
DMEM/F12Gibco11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)InvitrogenA31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)InvitrogenA31573
Donkey serumSigmaS30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasersBeckman coulterB52102
Fetal bovine serumGemini100-500
Fine scissorsFST14058-11
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
ForcepsFST11051-10
HemostatFST91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)Gibco13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)eBiosciences14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2ThermoFisher51033557
Inverted microscope - RevolveECHOn/a
LiberaseRoche5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x SupplementSTEMCELL technologies5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagentVector LaboratoriesMKB-2213
ParaformaldehydeSigmaP1648-500g
Penicillin-StreptomycinGibco15140–122
PicoLab Mouse Diet 20LabDiet3005750-220
Propidium iodide (PI)InvitrogenP3566
Transport vial 5mL tubeCaplugs Evergreen222-3005-080
Triton X-100Sigma9036-19-5

References

  1. Gaire, J., et al. Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin. NPJ Regen Med. 6, 1 (2021).
  2. Sandoval, A. G. W., Maden, M.

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