Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол описывает выделение фиброадипогенных предшественников (FAP) скелета и сердечной мышцы от колючей мыши (Acomys) с помощью ферментативной диссоциации и сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. FAP, полученные по этому протоколу, могут быть эффективно расширены и дифференцированы до миофибробластов и адипоцитов.

Abstract

Благодаря своей исключительной программе восстановления, колючая мышь является новой исследовательской моделью для регенеративной медицины. Фиброадипогенные предшественники представляют собой тканевые резидентные клетки, способные дифференцироваться в адипоциты, фибробласты и хондроциты. Фиброадипогенные предшественники имеют основополагающее значение для организации регенерации тканей, поскольку они отвечают за ремоделирование внеклеточного матрикса после травмы. Это исследование сосредоточено на изучении специфической роли фиброадипогенных предшественников в восстановлении сердца у колючих мышей и регенерации скелетных мышц. С этой целью был оптимизирован протокол для очистки фиброадипогенных предшественников колючих мышей методом проточной цитометрии из ферментативно диссоциированных скелетных и сердечных мышц. Популяция, полученная по этому протоколу, способна расширяться in vitro, и может быть дифференцирована до миофибробластов и адипоцитов. Этот протокол предлагает исследователям ценный инструмент для изучения отличительных свойств колючей мыши и сравнения их с мускулатурой. Это позволит получить понимание, которое может продвинуть понимание регенеративных механизмов в этой интригующей модели.

Introduction

Первоначально признанная своей исключительно хрупкой кожей и замечательной способностью восстанавливать повреждения кожи, колючая мышь продемонстрировала превосходную регенеративную способность в различных системах органов, таких как опорно-двигательный аппарат, почки, центральная нервная система и сердечно-сосудистая система, по сравнению с Mus musculus 1,2.

Фиброадипогенные предшественники (ФАП) представляют собой подмножество стромальных клеток, которые являются резидентами в различных тканях, включая скелетные и сердечные мышцы. Эти кле....

Protocol

Все процедуры содержания животных и эксперименты проводились в соответствии с одобрением Комитета по уходу за животными Университета Британской Колумбии и правилами Университета Британской Колумбии. Животные содержались в закрытом помещении, свободном от патоген?.......

Representative Results

Схема этого протокола для выделения и культивирования FAP скелетных мышц и сердца представлена на рисунке 1. При заборе тканей изменение цвета печени с темно-красного на бледно-желтый обычно свидетельствует об успешной перфузии. В указанных возрастных .......

Discussion

Колючие ткани мышей более чувствительны к стрессам при диссоциации тканей, и существует несколько аспектов этого протокола, направленных на минимизацию стресса для улучшения жизнеспособности клеток. Метод серийной ферментативной диссоциации используется для подг?.......

Acknowledgements

Мы хотели бы выразить признательность Энди Джонсону и Джастину Вонгу (Justin Wong), основному центру UBC flow, за их опыт и помощь в оптимизации протокола FACS, а также персоналу ветеринарного центра UBC Biomedical Research Center за уход за колючими мышами. Рисунок 1 выполнен с использованием Biorender. Рисунок 2 был сделан с использованием программного обеспечения FlowJo.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTAInvitrogen15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubesVWR87003-294
15 mL centrifuge tubeFalcon352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-144
20 mL syringeBD309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)InvitrogenD3571
40 μm cell strainerFalcon352340
48 well flat-bottom tissue culture plateFalcon53078
5 mL polypropyleneFalcon352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer capFalcon352235
5 mL syringeBD309646
50 mL centrifuge tubeFalcon352070
60 mm Petri dishFalcon353002
96 well V-bottom tissue culture plateCorning3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing bufferGibcoA10492-01
Anti-perilipin (1:100)SigmaP1873
Anti-SMA (1:100)Invitrogen14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)Abcamab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 GBD305195
BD PrecisionGlide Needle 23 GBD305145
Bovine serum albuminSigmaA7906-100g
BV605 CD31 (1:500)BD biosciences744359
CaCl2Sigma-AldrichC4901
CentrifugeEppendorf5810R
DMEM/F12Gibco11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)InvitrogenA31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)InvitrogenA31573
Donkey serumSigmaS30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasersBeckman coulterB52102
Fetal bovine serumGemini100-500
Fine scissorsFST14058-11
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
ForcepsFST11051-10
HemostatFST91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)Gibco13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)eBiosciences14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2ThermoFisher51033557
Inverted microscope - RevolveECHOn/a
LiberaseRoche5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x SupplementSTEMCELL technologies5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagentVector LaboratoriesMKB-2213
ParaformaldehydeSigmaP1648-500g
Penicillin-StreptomycinGibco15140–122
PicoLab Mouse Diet 20LabDiet3005750-220
Propidium iodide (PI)InvitrogenP3566
Transport vial 5mL tubeCaplugs Evergreen222-3005-080
Triton X-100Sigma9036-19-5

References

  1. Gaire, J., et al. Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin. NPJ Regen Med. 6, 1 (2021).
  2. Sandoval, A. G. W., Maden, M.

Explore More Articles

JoVE213in vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved