A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Этот протокол описывает выделение фиброадипогенных предшественников (FAP) скелета и сердечной мышцы от колючей мыши (Acomys) с помощью ферментативной диссоциации и сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. FAP, полученные по этому протоколу, могут быть эффективно расширены и дифференцированы до миофибробластов и адипоцитов.
Благодаря своей исключительной программе восстановления, колючая мышь является новой исследовательской моделью для регенеративной медицины. Фиброадипогенные предшественники представляют собой тканевые резидентные клетки, способные дифференцироваться в адипоциты, фибробласты и хондроциты. Фиброадипогенные предшественники имеют основополагающее значение для организации регенерации тканей, поскольку они отвечают за ремоделирование внеклеточного матрикса после травмы. Это исследование сосредоточено на изучении специфической роли фиброадипогенных предшественников в восстановлении сердца у колючих мышей и регенерации скелетных мышц. С этой целью был оптимизирован протокол для очистки фиброадипогенных предшественников колючих мышей методом проточной цитометрии из ферментативно диссоциированных скелетных и сердечных мышц. Популяция, полученная по этому протоколу, способна расширяться in vitro, и может быть дифференцирована до миофибробластов и адипоцитов. Этот протокол предлагает исследователям ценный инструмент для изучения отличительных свойств колючей мыши и сравнения их с мускулатурой. Это позволит получить понимание, которое может продвинуть понимание регенеративных механизмов в этой интригующей модели.
Первоначально признанная своей исключительно хрупкой кожей и замечательной способностью восстанавливать повреждения кожи, колючая мышь продемонстрировала превосходную регенеративную способность в различных системах органов, таких как опорно-двигательный аппарат, почки, центральная нервная система и сердечно-сосудистая система, по сравнению с Mus musculus 1,2.
Фиброадипогенные предшественники (ФАП) представляют собой подмножество стромальных клеток, которые являются резидентами в различных тканях, включая скелетные и сердечные мышцы. Эти кле....
Все процедуры содержания животных и эксперименты проводились в соответствии с одобрением Комитета по уходу за животными Университета Британской Колумбии и правилами Университета Британской Колумбии. Животные содержались в закрытом помещении, свободном от патоген?.......
Схема этого протокола для выделения и культивирования FAP скелетных мышц и сердца представлена на рисунке 1. При заборе тканей изменение цвета печени с темно-красного на бледно-желтый обычно свидетельствует об успешной перфузии. В указанных возрастных .......
Колючие ткани мышей более чувствительны к стрессам при диссоциации тканей, и существует несколько аспектов этого протокола, направленных на минимизацию стресса для улучшения жизнеспособности клеток. Метод серийной ферментативной диссоциации используется для подг?.......
Мы хотели бы выразить признательность Энди Джонсону и Джастину Вонгу (Justin Wong), основному центру UBC flow, за их опыт и помощь в оптимизации протокола FACS, а также персоналу ветеринарного центра UBC Biomedical Research Center за уход за колючими мышами. Рисунок 1 выполнен с использованием Biorender. Рисунок 2 был сделан с использованием программного обеспечения FlowJo.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5M EDTA | Invitrogen | 15575–038 | |
1.7 mL Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
20 mL syringe | BD | 309661 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
48 well flat-bottom tissue culture plate | Falcon | 53078 | |
5 mL polypropylene | Falcon | 352063 | |
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
5 mL syringe | BD | 309646 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
60 mm Petri dish | Falcon | 353002 | |
96 well V-bottom tissue culture plate | Corning | 3894 | |
Acomys dimidiatus mice (spiny mice) | kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky). | ||
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
Anti-perilipin (1:100) | Sigma | P1873 | |
Anti-SMA (1:100) | Invitrogen | 14-9760-82 | |
APC PDGFRa (1:800) | Abcam | ab270085 | |
BD PrecisionGlide Needle 18 G | BD | 305195 | |
BD PrecisionGlide Needle 23 G | BD | 305145 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906-100g | |
BV605 CD31 (1:500) | BD biosciences | 744359 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000) | Invitrogen | A31570 | |
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000) | Invitrogen | A31573 | |
Donkey serum | Sigma | S30-100ML | |
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers | Beckman coulter | B52102 | |
Fetal bovine serum | Gemini | 100-500 | |
Fine scissors | FST | 14058-11 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Forceps | FST | 11051-10 | |
Hemostat | FST | 91308-12 | |
human FGF-basic recombinant protein (bFGF) | Gibco | 13256029 | |
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1) | eBiosciences | 14-8348-62 | |
Incubator - Heracell 160i CO2 | ThermoFisher | 51033557 | |
Inverted microscope - Revolve | ECHO | n/a | |
Liberase | Roche | 5401127001 | |
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement | STEMCELL technologies | 5507 | |
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P1648-500g | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140–122 | |
PicoLab Mouse Diet 20 | LabDiet | 3005750-220 | |
Propidium iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
Transport vial 5mL tube | Caplugs Evergreen | 222-3005-080 | |
Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved