Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתאי Th17 פתוגניים במבחנה. באופן ספציפי, בשילוב עם גישה מבוססת ציטומטריה של זרימה מרובת פרמטרים, ניתן לקבל 90% טוהר של תאי Th17 פתוגניים מתאי T נאיביים CD4+ באמצעות שיטת התמיינות זו.

Abstract

במבחנה טכניקות התמיינות תאי T חיוניות לחקירות פונקציונליות ומכניסטיות של תאי T CD4+ . תאי Th17 פתוגניים נקשרו למגוון רחב של מחלות בתקופה האחרונה, כולל טרשת נפוצה (MS), דלקת מפרקים שגרונית, תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS), אלח דם והפרעות אוטואימוניות אחרות. עם זאת, פרוטוקולי התמיינות החוץ גופית הידועים כיום מתקשים להשיג טוהר גבוה של תאי Th17 פתוגניים, כאשר יעילות האינדוקציה לעתים קרובות נמוכה מ-50%, המהווה אתגר מרכזי בניסויים במבחנה . בפרוטוקול זה, אנו מציעים פרוטוקול משופר לתרבית חוץ גופית והתמיינות עבור תאי Th17 פתוגניים, המשמש להתמיינות ישירה של תאי CD4+ T נאיביים שבודדו מטחול עכבר לתאי Th17 פתוגניים. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות על בידוד טחול, טיהור תאי T נאיביים CD4+ והתמיינות של תאי Th17 פתוגניים. באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים להשיג טוהר התמיינות של כ-90% עבור תאי Th17 פתוגניים, אשר עונה על הצרכים הבסיסיים של ניסויים תאיים רבים.

Introduction

לאחר עזיבת בלוטת התימוס, לימפוציטים נאיביים מסוג CD4+ T עוברים דרך איברי לימפה משניים. תאים מציגי אנטיגן המעבירים אנטיגנים הומולוגיים לתאי T נאיביים CD4+ מפעילים אותם, ומתחילים סדרה של תוכניות התמיינות שבסופו של דבר מביאות לייצור שושלות תאי T עוזר (Th) מיוחדות מאוד1. ייצור אינטרלוקין 17 (IL-17) מאפיין תאי Th17, תת-אוכלוסייה של תאי Th פרו-דלקתיים2. תאי Th17 ממלאים תפקיד בהגנה של המארח מפני פתוגנים חוץ-תאיים ובפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות רבות, כגון אובאיטיס אוטואימונית וטרשת נפוצה. אותות מקולטני תאי T וציטוקינים IL-6 והפיכת גורם גדילה-β (TGF-β) גורמים להתמיינות של תאי T נאיביים לתאי Th17 באמצעות זרחן של מתמר אותות ומפעיל שעתוק (STAT)33. STAT3 מוגבר עוד יותר בלולאת משוב חיובי באמצעות איתות בתיווך IL-23 ו- IL-21 4,5. זרחן של STAT3 יכול לגרום לביטוי של גורמי השעתוק RORγt ו-RORα, הפועלים כמתגי אב המווסתים את פרופיל הציטוקינים של IL-17A, IL-17F, IL-21 ו-IL-22 בתאי Th176. עם זאת, דווח כי תאי Th17 המושרים על ידי IL-6 ו- TGF-β אינם מספיקים כדי לעורר מחלות אוטואימוניות, הדורשות גירוי משותף על ידי IL-23 או גירוי משותף נפרד של IL-6, IL-1β ו- IL-23 בהיעדר TGF-β 7,8.

תת-קבוצות Th17 שאינן יכולות לגרום ביעילות לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) מכונות לעיתים Th17 לא פתוגני, בעוד שתת-קבוצות Th17 שיכולות לגרום ל-EAE ידועות כ-Th179 פתוגני. מחקרים עכשוויים הראו כי למרות ש-Th17 פתוגני ו-Th17 לא פתוגני מבטאים יחד את גורם שעתוק הליבה RORγt, ישנם הבדלים גדולים ביכולת לייצר IL-17A ובתכונות פרו-דלקתיות ונוגדות דלקת10. בנוסף לביטוי הגבוה של RORγt, CCR6, STAT4 ו-RUNX4, שהם גורמי שעתוק אופייניים נפוצים של Th17, תאי Th17 פתוגניים מראים גם מאפייני ביטוי אותות גנים נוספים הקשורים למחלה, כגון TBX21, IFN-γ ו-CXCR3, שיש להם מאפיינים של תת-קבוצות תאי Th1. תאי Th17 פתוגניים יכולים להפריש רמות גבוהות של גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF), IFN-γ, TNF-α וציטוקינים אחרים11,12. הפנוטיפ של תאי Th17 שאינם פתוגניים אינו יציב, ורק תחת גירוי של CD3 וציטוקין IL-2 יכולים חלק מתאים אלה להתמיין לתאי Th17 פתוגניים. לכן, במודלים נפוצים של מחלות קליניות כגון דלקת מפרקים שגרונית, טרשת נפוצה ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה, תאי Th17 פתוגניים מפעילים בעיקר השפעות פתוגניות.

תאי Th17 פתוגניים ולא פתוגניים יכולים להתמיין במבחנה בהשפעת ציטוקינים שונים. בשנים האחרונות, מספר מחקרים הציעו שיטות לגרימת התמיינות של תאי Th17 באמצעות סוגים וריכוזים שונים של ציטוקינים. תאי Th17 מגורים על ידי שילוב של IL-6, IL-1β ו- IL-23 13,14,15,16. הוכח כי IL-6 ו-TGF-β, שני ציטוקינים הנחוצים להתמיינות תאי Th17, מווסתים באופן סינרגטי את הביטוי של התמיינות תאי RORγt ו-Th17 על ידי אינטראקציה עם שני רצפי דנ"א שונים שאינם מקודדים במוקד הגן Rorc 17. השלב היציב של תאי Th17 פתוגניים נשמר בעיקר על ידי IL-2318,19. IL-23 נקשר לקולטן שלו ומפעיל את מסלול האיתות JAK-STAT20, ובכך גורם לזרחון של Jak2 ו-Tyk2 ומקדם זרחן של STAT1, STAT3, STAT4 ו-STAT5. IL-4 ו- IFN-γ הם רגולטורים שליליים של מסלול זה. עם זאת, מחקרים הראו כי IL-1β עשוי לווסת באופן חיובי את השעתוק של Rorα ו- Rorγt דרך מסלול mTOR כדי לשמור על יציבות פנוטיפ התא Th1721.

בשל ההטרוגניות של מחקרים רבים, בחרנו את פרוטוקולי האינדוקציה עבור תאי Th17 פתוגניים ולא פתוגניים מהמחקרים האחרונים כבקרות22. התוצאות מצביעות על כך, בהנחה שהכל מתבצע על פי פרוטוקול זה, לאחר 5 ימים של תרבית במצב של יצירת Th17 פתוגני, יותר מ -90% מהתאים ששרדו יכולים להיות תאי Th17 פתוגניים.

Protocol

ועדת הביקורת המוסדית למחקרים בבעלי חיים באוניברסיטת דרום-מזרח אישרה את כל המחקרים בבעלי חיים המפורטים במחקר זה, שבוצעו בהתאם לתקנים מקומיים ומוסדיים כאחד. דגימות טחול נלקחו מעכברי C57BL6/J. הן עכברים נקבות והן זכרים, בגילאי 5 עד 8 שבועות, נכללו במחקר זה. מדיום התרבית והחיץ אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד. כלי ניתוח היו autoclaved לפני השימוש. ללבוש כפפות לטקס ומסכות כדי למנוע זיהום של העור, העיניים, בגדים עם ריאגנטים; יש להשתמש בהרבה מים או במי מלח לעור ולעיניים.

1. ציפוי מקדים של צלחת תרבית רקמות 24 בארות עם אנטי CD3

  1. לדלל אנטי-CD3 לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל במי מלח סטריליים חוצצי פוספט 1x (PBS) או RPMI 1640 בינוני.
  2. מלא צלחת תרבית רקמות 24 באר היטב עם 1 מ"ל של פתרון נגד CD3 (1 מיקרוגרם / מ"ל); לאחר מכן, לכסות את הבאר עם parafilm.
  3. הניחו את הצלחת המצופה נגד CD3 במקרר (2°C-8°C) למשך 16 שעות או שמרו אותה בטמפרטורה של 37°C באינקובטור תאים למשך 2-3 שעות.

2. בידוד טחול עכבר והכנת תרחיף טחול חד תאי

  1. יש להשרות הרדמה מלאה ב-C57BL/6J עם 3% איזופלורן ולהרדים על ידי שאיפת 100% פחמן דו-חמצני למשך 2 דקות. מיד לאחר מות העכברים, השרו אותם באתנול 75% לחיטוי למניעת זיהום.
  2. הניחו את העכבר במצב שכיבה על הספסל הנקי, חתכו אותו לאורך קו האמצע של הבטן והפרידו את מבני הבטן שכבה אחר שכבה. פתח בעדינות את האומנטום והקיבה הגדולים עם פינצטה, משוך בעדינות את הטחול עם הרצועה הגסטרופלנית, והפריד בבוטות את הטחול מהרקמות והרצועות שמסביב כדי לקבל טחול שלם (היזהר כדי למנוע ריסוק טחול או קרע).
    הערה: כדי לשמור על מצב סטרילי, הפעולה הבאה מתבצעת בספסל סטרילי סופר נקי.
  3. מניחים מסנן תאים בגודל 70 מיקרומטר בכלי תרבית סטרילית בקוטר 100 מ"מ, מוסיפים את הטחול למסננת התא ומועכים אותו בעזרת בוכנה מזרק. במקביל, להוסיף 5-8 מ"ל של נוזל שטיפה הומוגני כדי לדחוף את כל התאים דרך המסנן לתוך צלחת התרבית.
    הערה: ניתן לראות את הרכב ערכת הנוזלים להפרדת לימפוציטים בטבלת החומרים.
  4. צנטריפוגה את התסנין ב 450 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט.
  5. השהה מחדש את גלולת התא עם מדלל הדגימה שסופק עם ערכת הפרדת הלימפוציטים או עם מדיום PBS או RPMI 1640. התאם את ריכוז התא של תרחיף התא ל 2 × 108-1 × 109 תאים / מ"ל.
    הערה: בדרך כלל, 4-6 מ"ל של מדלל מדגם נדרש עבור טחול אחד.
  6. בצינור צנטריפוגה, קח את אותה כמות של תמיסת הפרדת לימפוציטים כמו תרחיף תא בודד רקמה. בזהירות פיפטה את התרחיף תא יחיד על פני השטח של פתרון הפרדת לימפוציטים צנטריפוגה ב 800 × גרם, 25 ° C במשך 30 דקות. הגדר את התאוצה וההאטה של הצנטריפוגה לטווח מתאים (למשל, הגדר על 3 אם יש את ההילוכים הרגילים 1 עד 9).
    הערה: פתרון הפרדת הלימפוציטים לא צריך להיות פחות מ 3 מ"ל.
  7. לאחר הצנטריפוגה, התבוננו בארבע השכבות בצינור הצנטריפוגה מלמעלה למטה. השכבה הראשונה מתאימה לדילול המדגם, ואחריו שכבת הלימפוציטים הלבנה החלבית הטבעתית. השכבה השלישית היא נוזל ההפרדה, והשכבה הרביעית מורכבת מתאי דם אדומים.
  8. השתמש פיפטה כדי למשוך בזהירות את השכבה השנייה של שכבת לימפוציטים לבנה חלבית טבעתית לתוך צינור צנטריפוגה אחר ולהוסיף 10 מ"ל של תמיסת ניקוי לצינור הצנטריפוגה כדי לערבב את התאים.
  9. צנטריפוגה ב 250 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט. השתמש 10 מ"ל של RPMI 1640 בינוני כדי להשעות מחדש את גלולת התא לספירת תאים.

3. טיהור תאי CD4+ T נאיביים על בסיס ברירה שלילית של חרוזים מגנטיים

הערה: בודד תאי T נאיביים CD4+ מטוהרים מאוד שלא נגעו בהם (CD4+CD44lowCD62Lhigh) מטחול עכבר על ידי ברירה שלילית אימונומגנטית.

  1. הכן את הדגימה כך שיהיו 1 × 108 תאים/מ"ל בטווח הנפח של 0.1-2 מ"ל.
  2. הוסף 50 μL / mL של סרום חולדות ולהעביר את הדגימה לצינור פוליסטירן עגול תחתון 5 מ"ל.
    הערה: ניתן לראות את הרכב ערכת מיון תאי CD4 T התמימה בטבלת החומרים.
  3. מוסיפים 50 μL/mL של קוקטייל בידוד לדגימה, מערבבים היטב ודגרים במשך 7.5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. מוסיפים 50 μL/mL של קוקטייל דלדול לדגימה, מערבבים היטב ודגרים במשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מערבלים את החרוזים המגנטיים כדי להבטיח פיזור אחיד. מוסיפים 75 μL/mL של החרוזים המגנטיים לדגימה, מערבבים היטב ודורים במשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: החלקיקים צריכים להופיע מפוזרים באופן שווה; זמן מערבולות לא צריך להיות פחות מ 30 שניות.
  6. טען את הדגימה עם RPMI 1640 בינוני עד נפח סופי של 2.5 מ"ל. מערבבים מספר פעמים על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה.
  7. הכניסו את הצינור (ללא המכסה) לתוך המגנט ודגרו במשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. מרימים את המגנט, הופכים את המגנט והצינור בתנועה רציפה אחת ויוצקים את תרחיף התאים המועשר לתוך צינור חדש.
    הערה: שמור את הצינור והמגנט הפוכים למשך 2-3 שניות לפני שתהפוך אותם לזקופים. אין להפריע לטיפות שעלולות להישאר על פי הצינור.
  9. קבע את מספר התא באמצעות המוציטומטר.
  10. בצעו אנליזה ציטומטרית של זרימה עבור תאי T נאיביים מסוג CD4+ לפני ואחרי בידוד (איור 1).
  11. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה חדש, צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ומשליכים את הסופרנטנט.
  12. להשהות מחדש את התאים ב 200-500 μL של RPMI 1640 בינוני (בתוספת 10% סרום בקר עוברי). עבור כל 1 מ"ל של תרבית תאים (למשל, ~ 106 תאים / מ"ל), להוסיף 2 μL של קוקטייל הפעלת לויקוציטים ולערבב אותו. תרבית את התאים באינקובטור CO2 ב 37 ° C ולחות רוויה במשך 4-6 שעות.
    הערה: התאים היו מערבלים אחת ל 1-2 שעות.
  13. צנטריפוגה את התאים ב 400 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות. בזהירות להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את התאים ב 200 μL של PBS. הוסף 1 μL של חוסם Fc לתאים (למשל, ~ 106 תאים/מ"ל). לדגור על התאים במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  14. לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS על ידי צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של PBS.
  15. הוסף קוקטייל נוגדנים (Fixable Viability Dye, 1:1,000; anti-CD4, 1:200; anti-CD44, 1:200; anti-CD62L, 1:200) ודגר על התאים במשך 15-20 דקות בחושך ב 4 ° C.
  16. לשטוף את התאים עם 2 x 1 מ"ל של PBS ולאחר מכן, צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  17. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים ב-250 מיקרוליטר של חיץ קבוע, ודגרו עליהם במשך 40-60 דקות בחושך ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: מאגר התיקון מסופק עם Foxp3/transcription factor staining buffer, שהוא פתרון מלאי 4x שיש לדלל עם מדלל permeabilization.
  18. הוסף 1 מ"ל של 1x permeabilization buffer כדי לשטוף את התאים 2x על ידי צנטריפוגה התאים ב 300 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות.
  19. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של חיץ חדירות, והוסיפו את הנוגדן (Foxp3 [גרעיני], 1:200) לתאים. לאחר קיבוע וקרע הממברנה, לדגור על תערובות נוגדנים התא בחושך במשך 40-60 דקות עם רעד מדי פעם לפרקי זמן קצרים ב 4 ° C.
    הערה: תמיסת Permeabilization/Wash היא תמיסת מלאי פי 10 שיש לדלל לפני השימוש עם PBS.

4. אינדוקציה של תאי Th17 פתוגניים במבחנה

  1. יש להסיר PBS סטרילי מלוחות 24 הקידודים המצופים מראש לפני השימוש.
  2. השתמש בתווך תרבית תאים Th17 (טבלה 1) ובמדיום ניגוד לתרבית, כולל מדיום תרבית תאים Th0 (טבלה 1), מדיום תרבית Th17 קלאסי לא פתוגני (טבלה 1) ומדיום תרבית תרבית פתוגנית קלאסית Th17 (טבלה 1). להשהות מחדש את תאי CD4 + T הנאיביים המועשרים ולחלק לבארות שונות באותה צלחת 24 בארות (מצופה מראש עם אנטי CD3), התאמת הריכוז ל 4 × 105 תאים / מ"ל, עם 1 מ"ל של בינוני בכל באר.
  3. הוסף 1 μL / מ"ל של תמיסת אנטי CD28 (ריכוז סופי: מדולל עם בינוני עד 2 מיקרוגרם / מ"ל) לכל באר. תרבית את התאים באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C במשך 5 ימים.
  4. החלף את המדיום העל-טבעי של תרבית התאים בתווך תרבית (Th0, Th17 לא פתוגני, Th17 פתוגני קלאסי ואובייקטיבי Th17) על ידי פיפטציה זהירה כדי לפזר את התאים באופן שווה, להשליך מחצית מהתווך המכיל את התאים, ולאחר מכן להוסיף תווך חדש השווה לנפח ההשלכה ביום השני. חזור על הפעולה ביום הרביעי.
  5. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ אופטי ביום 5 (איור 2). אספו את הסופרנאטנטים של התאים מכל קבוצה ושמרו אותם בהקפאה בטמפרטורה של -80°C.

5. אנליזה ציטומטרית של זרימה להתמיינות תאי Th17 ו-Th0 פתוגניים

  1. קצרו את כל התאים (לכל באר) לאחר 5 ימים של תחילת התרבית. בצע את שלבים 3.12-3.15.
  2. מוסיפים קוקטייל נוגדנים (Fixable Viability Dye, 1:1,000; anti-CD4, 1:200) ודגרים על התאים למשך 15-20 דקות בחושך ב-4°C.
  3. בצע את שלבים 3.17-3.19.
  4. להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של חיץ permeabilization, ולהוסיף קוקטייל נוגדנים (IL-17A [intracellular], 1:200; RORγT [גרעיני], 1:200) לתאים. לאחר קיבוע וקרע הממברנה, לדגור על תערובות נוגדנים התא בחושך במשך 40-60 דקות עם רעד מדי פעם לפרקי זמן קצרים ב 4 ° C.
  5. הוסף 1 מ"ל של 1x Permeabilization/Wash פתרון לשטוף את התאים 2x, צנטריפוגה התאים ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C; לאחר מכן, השליכו את הסופר-נטנט.
  6. בחנו את התאים בציטומטר זרימה ונתחו את הנתונים באמצעות התוכנה (איור 3).
    1. הפעל את ציטומטר הזרימה והפעל את תהליך הניקוי והכיול העצמי.
    2. בחר את תעלת הלייזר ששימשה בניסוי זה, והגדר צינור ריק, צינורות מוכתמים בודדים ושפופרות דגימה.
    3. לחץ על אפשרות הצינור הריק ובדוק במכונה; כוונן את המתח כך שאירוע התא יהיה, ככל האפשר, במרכז תיבת האיסוף.
    4. לאסוף תאי צינור מוכתמים בודדים ולבצע זיהוי ספקטרלי של התעלות המתאימות כדי לאשר כי נוגדן פלואורסצנטי נוסף כראוי.
    5. לחץ על לחצן ביטול הערבוב ואפשר למכונה להתאים אוטומטית את הפיצוי הספקטרלי. עם מכשירים ציטומטריית זרימה אחרים, להתאים את פיצוי פלואורסצנטיות בדרך כלל.
    6. אסוף כל תא צינור לדוגמה, שמור את תבנית הנתונים כקבצי FCS וייצוא. לנתח ולהתוות בתוכנה הרלוונטית לניתוח נתוני ציטומטריית זרימה.
      1. הקף את אוכלוסיית התאים הראשית והסר הידבקויות תאים אפשריות דרך שערי המעגל האלכסוניים של FSC-H ו- FSC-A.
      2. מעגל תאים חיים על פי אזור המעגל השלילי FVS; לאחר מכן, הקף את אוכלוסיית תאי CD4+.
      3. בנה את שער הצלב עם הציר האופקי כ- IL-17 A והציר האנכי כ- RORγT; הסלקציה החיובית הכפולה באזור Q2 היא אוכלוסיית תאי Th17.

6. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) לזיהוי הפרשת IL-17A הנגרמת על ידי מדיות שונות

  1. הפשירו את הסופרנאטנטים הקפואים של התאים שנאספו בסעיף 4.5.
  2. הוסף 100 μL של התקן המדולל, ריק, ודגימה לתוך הבארות המיועדות. השתמשו באטם כדי לכסות את הצלחת ולדגור במשך 90 דקות בטמפרטורה של 37°C.
    הערה: הוסיפו היטב את התמיסות לתחתית צלחת micro-ELISA מבלי לגעת בדופן הפנימית או לגרום להקצפה.
  3. דקרו את הנוזל מכל באר והוסיפו מיד 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של נוגדנים לזיהוי ביוטינילציה. השתמשו באטם חדש כדי לכסות את הצלחת ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C.
  4. דקרו את התמיסה והוסיפו 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה לכל באר. לאחר דקה, שאפו או רוקנו את התמיסה מכל באר וייבשו אותה בטפיחות קלות כנגד נייר סופג נקי. חזור על שלב זה של השטיפה 3x.
  5. הוסף 100 μL של חזרת peroxidase פתרון עבודה מצומד לכל באר. השתמשו באטם חדש כדי לכסות את הצלחת ולדגור במשך 30 דקות ב-37°C.
  6. נקו את התמיסה מכל באר, וחזרו על תהליך השטיפה פי 5 כמתואר בשלב 6.4.
  7. מוסיפים 90 μL של מגיב המצע לכל באר, ודגרים במשך כ -15 דקות ב 37 ° C עם אוטם חדש, המגן על הצלחת מפני אור.
    הערה: ניתן לשנות את זמן התגובה בהתבסס על שינוי הצבע בפועל, אך לא יעלה על 30 דקות. תן לקורא microplate להתחמם במשך ~ 15 דקות לפני מדידת OD.
  8. הוסף 50 μL / באר של תמיסת עצירה באותו סדר כמו תמיסת המצע.
  9. קבע את הצפיפות האופטית (ערך OD) של כל באר בבת אחת באמצעות קורא מיקרו-לוחות המוגדר ל- 450 ננומטר.
  10. קבל את ערכי OD עבור הדגימות הסטנדרטיות ושכפל בארות של הדגימות, והחסר את ערכי OD של הבארות הריקות כדי לקבל את הערכים המתוקנים. לאחר מכן, בצע התאמה ליניארית עם ריכוז כערך abscissa וערך OD כאורדינטה. בהתבסס על המשוואה המותאמת, חשב את ערכי הריכוז IL-17A עבור בארות הדגימה.
    הערה: לאחר 4 ימים של הבחנה, התוכן של IL-17A בסופרנאטנט של כל קבוצה מוצג באיור 4. שיטת ההתאמה יכולה להתייחס לתוכנת Orgin21. לעקומה הסטנדרטית המתקבלת מניסוי זה יש ערך R2 של 0.9946.

7. התמיינות תאי T על ידי בדיקות ביטוי גנים חתימה באמצעות PCR כמותי (qPCR)

הערה: כדי לשלול את האפשרות של חוסר יציבות ציטומטריית זרימה עקב השפעות של צבעים וקיבוע/קרע, זיהינו ביטוי של גנים אופייניים על ידי qPCR כדי להבהיר את אפקט ההתמיינות של Th17 פתוגני ברמת השעתוק.

  1. מדדו את מספר התאים בסוף תרבית תאי T. לאסוף את התאים בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות. בזהירות להשליך את כל supernatants.
  2. מיצוי RNA
    הערה: תהליך המיצוי חייב להתבצע במכסה אדים או בספסל נקי במיוחד כדי למנוע זיהום אנזים RNA.
    1. הוסף 500 μL של חיץ ליזיס (למשל, ל 1-2 × 106 תאים) לצינור הדגימה (שלב 7.1), מיד לנער ולערבב עד שאין מסת תא, ולתת לו לעמוד במשך 1 דקות.
    2. מוסיפים את התערובת לעמוד הספיחה המונח בצינור איסוף, צנטריפוגה במשקל 13,400 × גרם למשך 30 שניות, ומשליכים את התסנין.
    3. הוסף את הכמות שצוינה של אתנול מוחלט לבקבוק חיץ הכביסה לפני השימוש הראשון בו. מוסיפים 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה לעמוד הספיחה, צנטריפוגה ב-13,400 × גרם למשך 30 שניות, ומשליכים את התסנין.
    4. חזור על הכביסה בשלב 7.2.3.
    5. הניחו את עמוד הספיחה RA לתוך צינור האיסוף הריק והצנטריפוגה במשקל של 13,400 × גרם למשך 2 דקות כדי להסיר את תמיסת השטיפה.
      הערה: יש להסיר את תמיסת השטיפה כדי למנוע משאריות האתנול בתמיסת השטיפה לעכב את התגובה במורד הזרם.
    6. הסר את עמודת הספיחה RA והנח אותה בצינור צנטריפוגה נקי ללא RNase. הוסף 50 μL של H2O ללא RNase למרכז קרום הספיחה, תן לו לעמוד במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, וצנטריפוגה ב 9,600 × גרם למשך דקה אחת.
  3. למדוד את הטוהר והריכוז של RNA.
  4. סנתז את הגדיל הראשון של cDNA על-ידי ביצוע הוראות יצרן הערכה.
    1. הסר DNA גנומי. קח 500 ng של RNA תבנית מופק בצינור צנטריפוגה ללא RNase; הוסף תערובת ddH2O ו- 4x gDNA ללא RNase ליצירת תערובת. יש לערבב בעדינות עם פיפטה, ולהכניס לאמבט מים בטמפרטורה של 42°C למשך 2 דקות.
      הערה: כמות תערובת התגובה והכמות שנוספה קשורות לריכוז הרנ"א; עיין בהוראות בפירוט. מערכת התגובה של 20 μL שימשה בניסוי זה.
    2. הוסף ישירות מערכת תגובת שעתוק לאחור 5x בצינור התגובה של השלב הקודם. קח 4 μL של מערכת תגובת שעתוק לאחור ו 16 μL של התערובת מן השלב הקודם ומערבבים בעדינות עם פיפטה.
      הערה: מערכת התמלול ההפוך כוללת את כל התמלול ההפוך הנדרש, שהוא מערכת תמלול לאחור המוגדרת ישירות.
    3. הגדר את תגובת השעתוק ההפוך: 37 ° C 15 דקות, 85 ° C, 5 שניות, ולבסוף קריר ל 4 ° C.
  5. הגדר את תגובת ה-PCR בהתאם להוראות היצרן.
    1. הוסף 10 μL של 2x תערובת אנזימי תגובת PCR בצינור qPCR, 0.4 μL של פריימר 1, 0.4 μL של פריימר 2, 0.4 μL של 50x של צבע ייחוס ROX 1, 2 μL של cDNA תבנית ו- 6.8 μL של ddH2O כדי להכין תערובת של 20 μL.
    2. בצע PCR במכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת באמצעות ההגדרות הבאות: שלב 1, 95 °C, 30 שניות, Rep x 1; שלב 2, תחילה 95 מעלות צלזיוס, 10 שניות, ואז 60 מעלות צלזיוס, 30 שניות, נציג x 40; שלב 3, הראשון 95 ° C, 15 שניות, הבא 60 ° C, 60 שניות, לבסוף 95 ° C, 15 שניות, נציג x 1.
      הערה: לאחר 4 ימים של התמיינות, רמות הביטוי היחסיות של Il17a, Il17f, Rora ו- Il23r בתאי T נאיביים CD4+ מוצגות באיור 5.

Representative Results

הפרוטוקול שלנו פותח בהתבסס על מחקר קודם על התמיינות תאי Th17 פתוגניים. הצעד הראשון של הניסוי הוא לזהות את הטוהר של תאי CD4+ T נאיביים שבודדו מהטחול על ידי מיון חרוזים מגנטי, שהוא הבסיס להצלחת התמיינות תאי Th17 הפתוגניים שלנו. הטוהר של תאי T נאיביים CD4+ זוהה באמצעות סמני פני השטח CD62L23 ו- CD4424 ואילו FOXP325 שימש כסמן של תאי Treg. מצאנו שתכולת תאי Treg ירדה משמעותית לאחר המיון, והטוהר של תאי CD4+ T נאיביים יכול להגיע לפחות ל-95% (איור 1). כדי להשוות את ההתמיינות של תאי Th17 פתוגניים, תאי T נאיביים CD4+ גודלו בתרבית עם מדיום Th0 (טבלה 1) ומדיום התמיינות Th17 (טבלה 1) במשך 5 ימים בסך הכל. נמצא שתאי T הראו גידול בצביר גם במדיה Th0 וגם במדיה Th17 (איור 2).

לאחר מכן, התאים תוקנו, חדרו ותויגו בנוגדנים כנגד מספר ציטוקינים בתאי CD4+ T ממוינים בהתבסס על ציטומטריית זרימה. בחנו את IL17A26 ו-RORγT27 כציטוקינים הבולטים של התמיינות תאי Th17 ומצאנו ש-90% מתאי CD4+ T נאיביים התמינו בהצלחה לתאי Th17 פתוגניים תחת גירוי של מדיום תרבית תאי Th17 חדש (איור 3). איור 5 מראה את הגנים החתומים של תאי Th17 שזוהו על-ידי PCR, אשר הוכיחו שתאי Th17 הפתוגניים שקיבלנו באמצעות התמיינות התבטאו ביציבות.

figure-representative results-1585
איור 1: אסטרטגיית Gating לניתוח ציטוקינים ייחודיים בעכבר C57BL/6J לפני ואחרי בידוד תאי T נאיבי של CD4+ . קיצורים: FSC-H = גובה פיזור קדימה; SSC-H = גובה פיזור-אפונה בצד; FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי; FITC = isothiocyanate fluorescein; PE = phycoerythrin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-2197
איור 2: תמונות מייצגות של תאי T נאיביים של עכבר CD4+ שגודלו בתרבית בתנאים פתוגניים של Th17 ו-Th0 במשך 5 ימים. (A) תאי Th0; (B) תאי Th17 פתוגניים. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-2759
איור 3: ניתוח ציטומטריית זרימה לאחר התמיינות המושרה על-ידי תווך תרבית תאים Th0 ומדיום תרבית תאים Th17. קיצורים: FSC-H = גובה פיזור קדימה; SSC-H = גובה פיזור-אפונה בצד; FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי; FITC = isothiocyanate fluorescein; PE = phycoerythrin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-3358
איור 4: התוכן של IL-17A בסופרנאטנט של תווך תרבית תאים Th0 ובתווך תרבית תאים Th17 לאחר השראת התמיינות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-3803
איור 5: תוצאות מייצגות של רמות הביטוי של ציטוקינים חתומים בתאי CD4+ T ממוינים של עכבר C57BL/6J. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מדיום תרבית תאי Th17 פתוגני ממוקדמדיום תרבית תאים Th0מדיום תרבית תאי Th17 קלאסי לא פתוגנימדיום תרבית תאי Th17 פתוגני קלאסי.
מגיבריכוז סופיכמותריכוז סופיכמותריכוז סופיכמותריכוז סופיכמות
פניצילין-סטרפטומיצין (100x)1x500 μL1x500 μL1x500 μL1x500 μL
סרום בקר עוברי10%5 מ"ל10%5 מ"ל10%5 מ"ל10%5 מ"ל
β-מרקפטואתנול50 מיקרומטר50 מיקרוליטר50 מיקרומטר50 מיקרוליטר50 מיקרומטר50 מיקרוליטר50 מיקרומטר50 מיקרוליטר
תוסף GlutaMAXTM (100x)1x500 μL1x500 μL1x500 μL1x500 μL
תמיסת נתרן פירובט (100x)1 מ"מ500 μL1 מ"מ500 μL1 מ"מ500 μL1 מ"מ500 μL
גמא IFN נגד עכבר (1 מ"ג/מ"ל)5 מיקרוגרם/מ"ל250 מיקרוליטר10 מיקרוגרם/מ"ל500 μL10 מיקרוגרם/מ"ל500 μL
נגד עכבר IL-4 (2 מ"ג/מ"ל)5 מיקרוגרם/מ"ל125 מיקרוליטר5 מיקרוגרם/מ"ל250 מיקרוליטר10 מיקרוגרם/מ"ל250 מיקרוליטר
עכבר rIL-1 בטא (20 מיקרוגרם)20 נ"ג/מ"לנה
עכבר rIL-6 (20 מיקרוגרם)20 נ"ג/מ"לנה50 נ"ג/מ"לנה50 נ"ג/מ"לנה
עכבר rIL-23 (50 מיקרוגרם)50 נ"ג/מ"לנה10 נ"ג/מ"לנה
עכבר TGF בטא (100 מיקרוגרם)3 נ"ג/מ"לנה1 נ"ג/מ"לנה1 נ"ג/מ"לנה
מורין IL-2 (5 מיקרוגרם)20 נ"ג/מ"לנה
RPMI 1640נהעד 50 מ"לנהעד 50 מ"לנהעד 50 מ"ל
סךנה50 מ"לנה50 מ"לנה50 מ"ל

טבלה 1: תרבית תאי Th17 פתוגנית ממוקדת, תרבית תאי Th0, תרבית תאי Th17 קלאסית לא פתוגנית ופתוגנית.

Discussion

הליך זה הציע דרך פרודוקטיבית להגדיל את מספר תאי T CD4+ נאיביים של עכברים לייצור חוץ גופי של תאי Th17 פתוגניים. למרות שאנו משתמשים ביותר ציטוקינים מאשר תרביות תאים אחרות שדווחו על ידי תרביות תאי Th17, אנו מחויבים למטב את תנאי הגידול של תאי Th17 פתוגניים. אנו שוקלים אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול הבידול המושרה שלנו.

כאן, פשוט השתמשנו בציטומטריית זרימה וב-qPCR כדי לבחון את הייצור של ציטוקינים בולטים. עם כמה שינויים קלים, גישה זו יכולה לשמש גם עבור בדיקות תפקוד אחרות, כגון התפשטות תאים.

השתמשנו בערכת בידוד לימפוציטים מתוצרת סין כדי לבודד לימפוציטים של טחול עכבר מכיוון שהיא יעילה וחוסכת זמן. פתרונות הפרדת לימפוציטים המבוססים על מותגים אחרים יכולים גם להשיג את המטרה של הפרדת לימפוציטים טחול העכבר באמצעות שלבים שונים. שיטה נוספת היא ליזה ישירות את תאי הדם האדומים של השעיית תאי הטחול המתקבלים; עם זאת, מצאנו כי תאי דם אדומים טחול לעתים קרובות לא ניתן lysed בפעם אחת.

בעיות מסוימות יכולות להתעורר במהלך ביצוע פרוטוקול זה. ראשית, מספר תאי CD4+ T נאיביים המתקבלים על ידי מיון חרוזים מגנטיים עשוי להיות נמוך מאוד (שלב פרוטוקול 3). ניתן לייחס זאת לכך שתהליך ריסוק האיברים אינו מספיק. חשוב לוודא כי האיבר הוא הומוגני כראוי. הגדלת תדירות השטיפה בתהליך ההומוגניזציה תשפר את קצב ההחלמה. כדי להשיג מספר גבוה יותר של תאי T נאיביים של CD4+, אנו ממליצים להשתמש בעכברים צעירים יותר (בני 6-10 שבועות). ישנן שיטות שונות זמינות להפרדת לימפוציטים טחול, והתשואה עשויה להשתנות בהתאם לנוזל ההפרדה המשמש. מומלץ להשתמש בנוזל הפרדה מאושר אוניברסלית ולנסות לחלץ את שכבת הלימפוציטים ככל האפשר.

שנית, חלקם של תאי CD4+ T בציטומטריית זרימה עשוי להיות <80% (שלב פרוטוקול 5). סיבה אפשרית אחת לבעיה זו יכולה להיות ספירת טחול לא מדויקת, וכתוצאה מכך ספירת תאים גדולה יותר מזו של קוקטייל הנוגדנים הנוסף והחרוזים המגנטיים. כדי להגביר את היעילות של טיהור תאי T נאיבי CD4+, ספירת התאים חייבת להיות מדויקת. בנוסף, ניתן להשתמש ב-10% יותר קוקטייל נוגדנים וחרוזים מגנטיים מעבר למה שפרוטוקול זה ממליץ. לבסוף, ניתן לבצע ציטומטריית זרימה מיד לאחר מיון תאי T נאיביים CD4+ .

שלישית, ייתכן שלא נוצרו צבירי תאי T רבים במהלך התרבית, וייתכן שרוב התאים מתו במהלך התמיינות תאי T (שלב פרוטוקול 4). הסיבה הפוטנציאלית לבעיה זו עשויה להיות קביעה לא מדויקת של מספרי תאים עבור תאי CD4+ T נאיביים לפני הזריעה, וכתוצאה מכך צפיפות תאים נמוכה. מומלץ לאמץ שיטת ספירה מדויקת יותר כדי להשיג את צפיפות התאים הרצויה של כ 4 × 105 תאים / מ"ל עבור כל באר בצלחת 48 באר. סיבה אפשרית נוספת יכולה להיות בעיות טכניות באינקובטור CO2 , כגון טמפרטורה שגויה או ריכוז CO2 . לבסוף, כוח מופרז בעת שינוי מדיום תרבית התא עלול לגרום למוות תאי.

רביעית, רמות הביטוי היחסיות של גני הציטוקינים החתומים עשויות להיות נמוכות (שלב פרוטוקול 7). כדי להבטיח את האותנטיות של הרנ"א המופק, מומלץ להשתמש בריכוז זיהוי ננו-טיפות של יותר מ-100 ננוגרם/מ"ל. הסיבה הפוטנציאלית לירידה בריכוז עשויה להיות האופי הלא בריא של תאים בתרבית, כגון חלק גדול מהתאים שנאספו מתים או בתהליך מוות. כדי להשיג את ריכוז הרנ"א האמיתי, יש צורך לפתור את המצב שעלול להוביל לצמיחה לקויה במהלך תרבית התא. סיבה חלופית מאחורי חשש זה עשויה להיות ספירת התאים הסופית הנמוכה מדי שהושגה במהלך מיצוי RNA, אולי בשל אובדן תאים בשוגג במהלך סילוק supernatant. שימוש בטכניקות מיצוי RNA מתקדמות כגון ערכות מיצוי RNA חד-שלבי עשוי להוות יתרון. יחס OD260/OD280 האידיאלי, כפי שנמדד על-ידי Nanodrop, אמור להיות בטווח של 1.9-2.1. במקרה של יחס נמוך מדי, זיהום חלבון הופך לאפשרות. הגדלת התדירות של שטיפת חיץ ללא RNase עשויה לסייע בהפחתת בעיה זו. לעומת זאת, יחס נמוך באופן לא אופייני מרמז על פירוק RNA פוטנציאלי. כדי לנטרל בעיה זו, מומלץ להשתמש במים נטולי RNase ולהשתמש בצינורות 1.5 מ"ל למטרות טיהור RNase.

לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בתווך תרבית תאים חדש כדי לגרום ישירות לתאי CD4+ T נאיביים להתמיין לתאי Th17 פתוגניים במבחנה. בהשוואה להפרדה ישירה, אין ספק ששיטה זו ישירה יותר, זולה ויעילה יותר. תצורת המדיום היא גם פשוטה מאוד, כך שתאי Th17 שנבנו יכולים לשמש באופן אינטואיטיבי יותר לניסויים הבאים, ומספקים מודל תאים טוב מאוד לחקר מחלות רבות.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בנוגע לפרסום מאמר זה.

Acknowledgements

העבודה נתמכה על ידי תוכנית המו"פ הלאומית של סין (No.2022YFC2304604), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.81971812), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.82272235), הקרן המדעית של ועדת הבריאות של מחוז ג'יאנגסו (No. ZDB2020009), מחוז ג'יאנגסו מחקר מפתח, תוכנית פיתוח (פיתוח חברתי) פרויקט מיוחד (מס 'BE2021734), תוכנית מו"פ מפתח לאומי של משרד המדע והטכנולוגיה (מס '2020YFC083700), מעבדת המפתח המחוזית של ג'יאנגסו לרפואת טיפול קריטי (BM2020004), פרויקט מפתח של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81930058), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82171717), קרנות מחקר בסיסיות של אוניברסיטאות מרכזיות (2242022K4007), והפרויקט הכללי של הקרן המחוזית למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (BK20211170).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Rat anti-mouse CD62L, BV650, clone MEL-14, 1:200 dilutionBDCat# 564108; RRID: AB_2738597
Rat monoclonal anti-CD4, FITC, clone RM4-5, 1:200 dilutionBioLegendCat#100509; RRID: AB_312712
Rat monoclonal anti-IL-17A, PE, clone TC11-18H10.1, 1:200 dilutionBioLegendCat#506903; RRID: AB_ 315463
Rat monoclonal anti mouse/human CD44, APC, clone IM&, 1:200 dilutionBioLegendCat#103012; RRID: AB_312963
Rat monoclonal anti-RORγT, APC, clone B2D, 1:200 dilutionInvitrogenCat#17-6981-80; RRID: AB_2573253
Rat monoclonal FOXP3 antibody, PE, clone FJK-16s, 1:200 dilutionInvitrogenCat#12-5773-82; RRID: AB_465936
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
Anti-Mouse CD3 SAFIRE purifiedbiogemsCat#05112-25
Anti-Mouse CD28 SAFIRE purifiedbiogemsCat#10312-25
Anti-Mouse IFN gammabiogemsCat#80822-25
Anti-Mouse IL-4biogemsCat#81112-25
EthanolXilong scientificCat#64-17-5
Fetal bovine serumGibcoCat#10437-028
FcR Blocking reagentMiltenyi BiotecCat#130-092-575
GlutaMAX supplementgibcoCat#35050079
Mouse rIL-1 betaSino BiologicalCat#50101-MNAE
Mouse rIL-6Sino BiologicalCat#50136-MNAE
Mouse rIL-23Sino BiologicalCat#CT028-M08H
Mouse TGF beta 1Sino BiologicalCat#50698-M08H
PBSProcellCat#PB180327
Recombinant Murine IL-2peprotechCat#212-12
RPMI 1640 with L-glutamineGibcoCat#11875-119
Penicillin-streptomycin solutionGibcoCat#15070063
β-mercaptoethanolSigma-AldrichCat#M6250-100ML
Critical commercial assays
Animal Organ Lymphocyte Separation Solution KitTbdscienceCat#TBD0018SOPContains animal spleen tissue lymphocyte separation liquid, tissue sample diluent (cat no. 2010C1119), sample cleaning solution (cat no. 2010X1118), sample washing solution (cat no. TBTDM-W), tissue homogenate flushing liquid (F2013TBD)
ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)VazymeCat#Q341-02https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html.
Fixation/permeabilization ConcentrateinvitrogenCat#00-5123-43
Fixation / Permeabilization DiluentinvitrogenCat#00-5223-56
Fixable Viability Dye EF506invitrogenCat#65-0866
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)VazymeCat#R223-01https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html.
Leukocyte Activation CocktailBDCat#550583
Mouse IL-17A (Interleukin 17A) ELISA KitElabscience®Cat#E-EL-M0047
Naïve CD4+ T cells isolation kit, mouseSTEMCELLCat#19765EasySep kit contains mouse CD4+ T cell isolation cocktail [cat no. 19852C.1], mouse memory T cell depletion cocktail [cat no. 18766C], streptavidin RapidSphered 50001 [cat no. 50001], normal rat serum [cat no. 13551]); only store rat serum at -20 °C; other components to be stored at 2-8 °C.
Permeabilization BufferinvitrogenCat#00-8333-56
SPARKeasy Cell RNA KitSparkjadeCat#AC0205-Bhttps://www.sparkjade.com/product/detail?id=85
Experimental models: Organisms/strains
Mouse: C57BL/6GempharmatechCat#000013
Oligonucleotides
Mouse Il17a TaqMan primers with proberibobioNA
Mouse Il17f TaqMan primers with proberibobioNA
Mouse Il23r TaqMan primers with proberibobioNA
Mouse Rora TaqMan primers with proberibobioNA
β-actin TaqMan primers with proberibobioNA
Software and algorithms
Cytek AuroraCytekhttps://spectrum.cytekbio.com/
FlowJo v10.8.1Tree Starhttps://www.flowjo.com
GraphPad prism 9GraphPad Softwarehttps://www.graphpad-prism.cn
Other
1 mL syringeKindlyNA
1.5 mL Centrifuge tubesEppendorfCat#MCT-150-C
5 mL Round-bottom tubesCorningCat#352235
15 mL Centrifuge tubesNESTCat#601052
48-Well tissue culture plate (flatten bottom)CorningCat#3548
50 mL Centrifuge tubesNESTCat#602052
70 µm Cell strainerBiosharpCat#BS-70-XBS
96-well Unskirted qPCR PlatesVIOX scientificCat#V4801-M
100 mm Petri dishCorningCat#430167
CentrifugeEppendorf5425R
Cell culture CO2 incubatorThermo FisherHEPA Class100
Cytek AuroraCytekNA
dissecting scissorsRWDS12003-09
HemocytometerAlphaCellCat#J633201
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo FisherND-2000
Real-time PCR SystemRocheLightCycler96
Surgical tweezersRWDF12005-10
Thermal cyclerBio-RadC1000 Touch

References

  1. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  2. Bhaumik, S., Basu, R. Cellular and molecular dynamics of Th17 differentiation and its developmental plasticity in the intestinal immune response. Front Immunol. 8, 254 (2017).
  3. Bettelli, E., Korn, T., Oukka, M., Kuchroo, V. K. Induction and effector functions of T(H)17 cells. Nature. 453 (7198), 1051-1057 (2008).
  4. Korn, T., et al. IL-21 initiates an alternative pathway to induce proinflammatory T(H)17 cells. Nature. 448 (7152), 484-487 (2007).
  5. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).
  6. Yang, X. O., et al. T helper 17 lineage differentiation is programmed by orphan nuclear receptors ROR alpha and ROR gamma. Immunity. 28 (1), 29-39 (2008).
  7. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
  8. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  9. McGeachy, M. J., et al. The interleukin 23 receptor is essential for the terminal differentiation of interleukin 17-producing effector T helper cells in vivo. Nat Immunol. 10 (3), 314-324 (2009).
  10. Wu, B., et al. The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation. Immunity. 54 (2), 308-323 (2021).
  11. Ramesh, R., et al. Pro-inflammatory human Th17 cells selectively express P-glycoprotein and are refractory to glucocorticoids. J Exp Med. 211 (1), 89-104 (2014).
  12. Basdeo, S. A., et al. Ex-Th17 (nonclassical Th1) cells are functionally distinct from classical Th1 and Th17 cells and are not constrained by regulatory T cells. J Immunol. 198 (6), 2249-2259 (2017).
  13. Cua, D. J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421 (6924), 744-748 (2003).
  14. Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182 (10), 5904-5908 (2009).
  15. Jäger, A., Dardalhon, V., Sobel, R. A., Bettelli, E., Kuchroo, V. K. Th1, Th17, and Th9 effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis with different pathological phenotypes. J Immunol. 183 (11), 7169-7177 (2009).
  16. Lee, Y., Collins, M., Kuchroo, V. K. Unexpected targets and triggers of autoimmunity. J Clin Immunol. 34, S56-S60 (2014).
  17. Chang, D., et al. The conserved non-coding aequences CNS6 and CNS9 control cytokine-induced Rorc transcription during T helper 17 cell differentiation. Immunity. 53 (3), 614-626 (2020).
  18. Bunte, K., Beikler, T. Th17 cells and the IL-23/IL-17 axis in the pathogenesis of periodontitis and immune-mediated inflammatory diseases. Int J Mol Sci. 20 (14), 3394 (2019).
  19. Zhao, Y., Liu, Z., Qin, L., Wang, T., Bai, O. Insights into the mechanisms of Th17 differentiation and the Yin-Yang of Th17 cells in human diseases. Mol Immunol. 134, 109-117 (2021).
  20. Berghmans, N., et al. Interferon-γ orchestrates the number and function of Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Interferon Cytokine Res. 31 (7), 575-587 (2011).
  21. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic Th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187 (2020).
  22. Du, L., et al. Growth hormone releasing hormone signaling promotes Th17 cell differentiation and autoimmune inflammation. Nat Commun. 14 (1), 3298 (2023).
  23. Ernst, D. N., Weigle, W. O., Noonan, D. J., McQuitty, D. N., Hobbs, M. V. The age-associated increase in IFN-gamma synthesis by mouse CD8+ T cells correlates with shifts in the frequencies of cell subsets defined by membrane CD44, CD45RB, 3G11, and MEL-14 expression. J Immunol. 151 (2), 575-587 (1993).
  24. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  25. El-Hindi, K., et al. T-cell-specific CerS4 depletion prolonged inflammation and enhanced tumor burden in the AOM/DSS-induced CAC model. Int J Mol Sci. 23 (3), 1866 (2022).
  26. Cooney, L. A., Towery, K., Endres, J., Fox, D. A. Sensitivity and resistance to regulation by IL-4 during Th17 maturation. J Immunol. 187 (9), 4440-4450 (2011).
  27. Zhu, X., et al. A novel interleukin-2-based fusion molecule, HCW9302, differentially promotes regulatory T cell expansion to treat atherosclerosis in mice. Front Immunol. 14, 1114802 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE212CD4 TTh17

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved