Дифференцировка in vitro наивных CD4+ Т-клеток в патогенные клетки Th17 у мышей

Summary

Этот протокол описывает дифференцировку наивных CD4⁺ Т-клеток в патогенные клетки Th17 in vitro. В частности, в сочетании с подходом, основанным на многопараметрической проточной цитометрии, 90% чистота патогенных клеток Th17 может быть получена из наивных CD4⁺ Т-клеток с использованием этого метода дифференцировки.

Abstract

In vitro Методы дифференцировки Т-клеток имеют важное значение как для функциональных, так и для механистических исследований CD4⁺ Т-клеток. В последнее время патогенные клетки Th17 были связаны с широким спектром заболеваний, включая рассеянный склероз (РС), ревматоидный артрит, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), сепсис и другие аутоиммунные расстройства. Тем не менее, известные в настоящее время протоколы дифференцировки in vitro испытывают трудности с достижением высокой чистоты патогенных клеток Th17, при этом эффективность индукции часто ниже 50%, что является ключевой проблемой в экспериментах in vitro . В этом протоколе мы предлагаем расширенный протокол культивирования и дифференцировки in vitro для патогенных клеток Th17, который используется для прямой дифференцировки наивных CD4⁺ Т-клеток, выделенных из селезенки мышей, в патогенные клетки Th17. Этот протокол содержит подробные инструкции по выделению спленоцитов, очистке наивных CD4⁺ Т-клеток и дифференцировке патогенных клеток Th17. Благодаря этому протоколу мы можем достичь чистоты дифференцировки примерно 90% для патогенных клеток Th17, что удовлетворяет основные потребности многих клеточных экспериментов.

Introduction

После выхода из тимуса наивные CD4⁺ Т-лимфоциты проходят через вторичные лимфоидные органы. Антигенпрезентирующие клетки, которые передают гомологичные антигены наивным CD4⁺ Т-клеткам, активируют их, запуская серию программ дифференцировки, которые в конечном итоге приводят к производству высокоспециализированных линий Т-хелперов (Th)¹. Продукция интерлейкина 17 (IL-17) характеризует клетки Th17, субпопуляцию провоспалительных Th-клеток². Клетки Th17 играют роль в защите хозяина от внеклеточных патогенов и в патогенезе многих аутоиммунных заболеваний, таких как аутоиммунный увеит и рассеянный склероз. Сигналы от Т-клеточных рецепторов и цитокинов IL-6 и трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) индуцируют дифференцировку наивных Т-клеток в клетки Th17 путем фосфорилирования сигнального преобразователя и активатора транскрипции (STAT)3³. STAT3 дополнительно усиливается в петле положительной обратной связи через сигнализацию, опосредованную IL-23 и IL-21 ^4,5. Фосфорилирование STAT3 может индуцировать экспрессию транскрипционных факторов RORγt и RORα, которые действуют как главные переключатели, регулирующие цитокиновый профиль IL-17A, IL-17F, IL-21 и IL-22 в клетках Th17⁶. Тем не менее, сообщалось, что IL-6- и TGF-β-индуцированные клетки Th17 недостаточны для запуска аутоиммунных заболеваний, которые требуют костимуляции IL-23 или отдельной костимуляции IL-6, IL-1β и IL-23 в отсутствие TGF-β ^7,8.

Субпопуляции Th17, которые не могут эффективно индуцировать экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), иногда называют непатогенными Th17, в то время как субпопуляции Th17, которые могут индуцировать EAE, известны как патогенные Th17⁹. Современные исследования показали, что, хотя патогенный Th17 и непатогенный Th17 совместно экспрессируют основной фактор транскрипции RORγt, существуют большие различия в способности продуцировать IL-17A и провоспалительных^и противовоспалительных свойствах. В дополнение к высокой экспрессии RORγt, CCR6, STAT4 и RUNX4, которые являются общими характерными факторами транскрипции Th17, патогенные клетки Th17 также демонстрируют дополнительные характеристики экспрессии сигналов генов, связанные с заболеванием, такие как TBX21, IFN-γ и CXCR3, которые обладают характеристиками субпопуляций клеток Th1. Патогенные клетки Th17 могут секретировать высокие уровни гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), ИФН-γ, TNF-α и других цитокинов^11,12. Фенотип непатогенных клеток Th17 нестабилен, и только при стимуляции CD3 и цитокина IL-2 часть этих клеток может дифференцироваться в патогенные клетки Th17. Таким образом, в распространенных клинических моделях заболеваний, таких как ревматоидный артрит, рассеянный склероз и острый респираторный дистресс-синдром, патогенные клетки Th17 в первую очередь оказывают патогенное действие.

Патогенные и непатогенные клетки Th17 могут дифференцироваться in vitro под влиянием различных цитокинов. В последние годы в нескольких исследованиях были предложены методы индуцирования дифференцировки клеток Th17 с использованием различных типов и концентраций цитокинов. Клетки Th17 стимулируются комбинацией IL-6, IL-1β и IL-23 13,14,15,16. Доказано, что IL-6 и TGF-β, два цитокина, необходимые для дифференцировки клеток Th17, синергетически регулируют экспрессию дифференцировки клеток RORγt и Th17, взаимодействуя с двумя различными консервативными некодирующими последовательностями ДНК в локусе гена Rorc ¹⁷. Стабильная фаза патогенных клеток Th17 в основном поддерживается IL-23^18,19. IL-23 связывается со своим рецептором и активирует сигнальный путь²⁰ JAK-STAT, тем самым вызывая фосфорилирование Jak2 и Tyk2 и способствуя фосфорилированию STAT1, STAT3, STAT4 и STAT5. IL-4 и ИФН-γ являются негативными регуляторами этого пути. Тем не менее, исследования показали, что IL-1β может положительно регулировать транскрипцию Rorα и Rorγt через путь mTOR для поддержания стабильности фенотипа клеток Th17²¹.

В связи с гетерогенностью многочисленных исследований в качестве контроля были выбраны протоколы индукции патогенных и непатогенных клеток Th17 из последних исследований²². Полученные результаты свидетельствуют о том, что, если предположить, что все проводится по этому протоколу, после 5 дней культивирования при условии генерации патогенного Th17 более 90% выживших клеток могут быть патогенными клетками Th17.

Protocol

Институциональный комитет по обзору исследований на животных при Юго-Восточном университете одобрил все исследования на животных, подробно описанные в этом исследовании, которые были проведены в соответствии как с местными, так и с институциональными стандартами. Образцы селезенки были взяты у мышей C57BL6/J. В исследование были включены как самки, так и самцы мышей в возрасте от 5 до 8 недель. Питательную среду и буфер хранили при температуре 4 °С до 1 месяца. Хирургические инструменты перед использованием были автоклавированы. Надевайте латексные перчатки и маски, чтобы избежать загрязнения кожи, глаз и одежды реагентами; Используйте много воды или солевого ополаскивателя для кожи и глаз.

1. Предварительное покрытие 24-луночного тканевого планшета анти-CD3

1. Разбавьте анти-CD3 до конечной концентрации 1 мкг/мл в стерильном 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) или среде RPMI 1640.
2. Заполните 24-луночный тканевой планшет 1 мл раствора анти-CD3 (1 мкг/мл); Затем накройте лунку парапленкой.
3. Поместите пластину с анти-CD3-покрытием в холодильник (2-8 °C) на 16 часов или держите ее при температуре 37 °C в камерном инкубаторе в течение 2-3 часов.

2. Выделение селезенки мыши и приготовление суспензии селезенки из одноклеточных клеток

1. Вызвать полную анестезию в C57BL/6J с 3% изофлураном и усыпить путем вдыхания 100% углекислого газа в течение 2 мин. Сразу после смерти мышей замочите их в 75% этаноле для дезинфекции, чтобы предотвратить заражение.
2. Поместите мышь в лежачем положении на чистую скамейку, разрежьте ее по средней линии живота и разделите структуры брюшной полости слой за слоем. Аккуратно вскройте пинцетом большой сальник и желудок, аккуратно вытяните селезенку с гастроселезеночной связкой и тупо отделите селезенку от окружающих тканей и связок, чтобы получить неповрежденную селезенку (будьте осторожны, чтобы избежать раздавливания селезенки или разрыва).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания стерильного состояния в стерильном супер чистом скамейке проводится следующая операция.
3. Поместите клеточный фильтр 70 мкм в 100-миллиметровую стерильную чашку для культур, добавьте селезенку в клеточное ситечко и раздавите его поршенем шприца. В это же время добавьте 5-8 мл гомогенатной промывочной жидкости, чтобы протолкнуть все клетки через фильтр в чашку для культивирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав набора жидкостей для разделения лимфоцитов можно увидеть в Таблице материалов.
4. Центрифугируйте фильтрат при 450 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость.
5. Ресуспендируйте клеточную гранулу с помощью разбавителя образца, входящего в комплект для разделения лимфоцитов, или среды PBS или RPMI 1640. Отрегулируйте клеточную концентрацию клеточной суспензии до 2 ×^{10 8-1} × 10⁹ клеток/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, требуется 4-6 мл разбавителя образца на одну селезенку.
6. В пробирку для центрифуги возьмите такое же количество раствора для разделения лимфоцитов, как и для тканевой суспензии одиночных клеток. Осторожно нанесите суспензию одиночных клеток на поверхность раствора для разделения лимфоцитов и центрифугируйте при 800 × г, 25 °C в течение 30 мин. Установите ускорение и замедление центрифуги в соответствующий диапазон (например, установите значение 3, если есть обычные передачи от 1 до 9).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для разделения лимфоцитов должен быть не менее 3 мл.
7. После центрифугирования наблюдайте за четырьмя слоями в центрифужной пробирке сверху донизу. Первый слой соответствует разбавителю образца, за ним следует кольцевой молочно-белый слой лимфоцитов. Третий слой представляет собой разделительную жидкость, а четвертый слой состоит из эритроцитов.
8. С помощью пипетки осторожно втяните второй слой кольцевого молочно-белого слоя лимфоцитов в другую центрифужную пробирку и добавьте 10 мл чистящего раствора в центрифужную пробирку, чтобы перемешать клетки.
9. Центрифугировать при 250 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость. Используйте 10 мл среды RPMI 1640 для ресуспендирования клеточной гранулы для подсчета клеток.

3. Очищение наивных CD4⁺ Т-клеток на основе отрицательного отбора магнитных шариков

Примечание: Изолируйте нетронутые и высокоочищенные наивные CD4⁺ Т-клетки (CD4⁺CD44lowCD62Lhigh) из спленоцитов мышей путем иммуномагнитного отрицательного отбора.

1. Подготовьте образец так, чтобы в нем было от 1 ×^до 10 8 клеток/мл в диапазоне объема 0,1-2 мл.
2. Добавьте 50 л/мл сыворотки крови крысы и перенесите образец в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С составом наивного набора для сортировки CD4 Т-клеток можно ознакомиться в Таблице материалов.
3. Добавьте в образец 50 мкл/мл изоляционного коктейля, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 7,5 минут при комнатной температуре.
4. Добавьте в образец 50 мкл/мл коктейля Depletion, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 2,5 минут при комнатной температуре.
5. Сделайте магнитные шарики вихревыми для обеспечения равномерного дисперсии. Добавьте в образец 75 л/мл магнитных шариков, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 2,5 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частицы должны казаться равномерно диспергированными; Время вортекса должно быть не менее 30 с.
6. Долейте образец со средой RPMI 1640 до конечного объема 2,5 мл. Перемешайте несколько раз, аккуратно пипетируя вверх и вниз.
7. Поместите пробирку (без крышки) в магнит и выдерживайте 2,5 минуты при комнатной температуре.
8. Взяв в руки магнит, переверните магнит и трубку одним непрерывным движением и вылейте обогащенную клеточную суспензию в новую пробирку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите трубку и магнит перевернутыми в течение 2-3 секунд, прежде чем поворачивать их в вертикальном положении. Не тревожьте капли, которые могут остаться на горловине трубки.
9. Определяют номер клеток с помощью гемоцитометра.
10. Проведите проточный цитометрический анализ наивных CD4⁺ Т-клеток до и после выделения (рис. 1).
11. Переложите клетки в новую центрифужную пробирку, центрифугируйте при 400 × г в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
12. Ресуспендируйте клетки в 200-500 мкл среды RPMI 1640 (с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки). На каждый 1 мл клеточной культуры (например, ~106 клеток/мл) добавьте 2 мкл коктейля для активации лейкоцитов и перемешайте. Культивировать клетки в CO2-инкубаторе при температуре 37 °C и насыщенной влажности в течение 4-6 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Камеры подвергались вихревому ремонту один раз в 1-2 ч.
13. Центрифугируйте ячейки при 400 × г, 4 °C в течение 5 минут. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 200 мкл PBS. Добавьте в клетки 1 мкл блокатора Fc (например, ~106 клеток/мл). Инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 4 °C.
14. Промойте клетки один раз 1 мл PBS центрифугированием при 400 × г в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 200 мкл PBS.
15. Добавьте коктейль антител (Fixable Viability Dye, 1:1000; анти-CD4, 1:200; анти-CD44, 1:200; анти-CD62L, 1:200) и инкубируйте клетки в течение 15-20 мин в темноте при 4 °C.
16. Промойте ячейки 2 x 1 мл PBS, а затем центрифугируйте при 400 × г в течение 5 минут при 4 °C.
17. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 250 мкл фиксированного буфера и инкубируйте их в течение 40-60 мин в темноте при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фикс-буфер поставляется с буфером для окрашивания Foxp3/транскрипционного фактора, который представляет собой 4-кратный стоковый раствор, который должен быть разбавлен разбавителем для пермеабилизации.
18. Добавьте 1 мл 1x пермеабилизационного буфера, чтобы промыть клетки 2 раза, центрифугируя клетки при 300 × г, 4 °C в течение 5 минут.
19. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 200 мкл буфера для пермеабилизации и добавьте антитело (Foxp3 [ядерный], 1:200) к клеткам. После фиксации и разрыва мембраны смеси клеток-антител инкубировать в темноте в течение 40-60 мин, периодически встряхивая в течение коротких периодов времени при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для пермеабилизации/промывки представляет собой 10-кратный исходный раствор, который необходимо разбавить перед использованием PBS.

4. Индукция патогенных клеток Th17 in vitro

1. Перед использованием удалите стерильный PBS с предварительно покрытых 24-луночных планшетов.
2. Для культивирования используют среду для культивирования клеток Th17 (Таблица 1) и контрастное вещество, включая среду для культивирования клеток Th0 (Таблица 1), классическую непатогенную среду для культур Th17 (Таблица 1) и классическую патогенную среду для культур Th17 (Таблица 1). Ресуспендируют обогащенные наивные CD4+ Т-клетки и дозируют в разные лунки в том же 24-луночном планшете (предварительно покрытом анти-CD3), регулируя концентрацию до 4 × 10⁵ клеток/мл, по 1 мл среды в каждой лунке.
3. Добавьте по 1 мкл/мл раствора анти-CD28 (конечная концентрация: разбавленная средой до 2 мкг/мл) в каждую лунку. Культивируйте клетки в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при 37 °C в течение 5 дней.
4. Замените надосадочную среду для клеточных культур питательной средой (Th0, непатогенный Th17, классический патогенный Th17 и объективный Th17) путем тщательного пипетирования для равномерного распределения клеток, отбросьте половину среды, содержащей клетки, а затем добавьте новую среду, равную объему отбраковки на 2-й день. Повторите на 4 день.
5. Наблюдайте за клетками под оптическим микроскопом на 5-й день (рис. 2). Соберите надосадочную жидкость из каждой группы и криоконсервируйте их при температуре -80 °C.

5. Проточный цитометрический анализ на патогенную дифференцировку клеток Th17 и Th0

1. Соберите все клетки (в лунку) через 5 дней после начала культивирования. Выполните шаги 3.12-3.15.
2. Добавьте коктейль антител (Fixable Viability Dye, 1:1000; anti-CD4, 1:200) и инкубируйте клетки в течение 15-20 минут в темноте при 4 °C.
3. Выполните шаги 3.17-3.19.
4. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 200 мкл буфера для пермеабилизации и добавьте коктейль антител (IL-17A [внутриклеточный], 1:200; RORγT [ядерный], 1:200) к клеткам. После фиксации и разрыва мембраны смеси клеток-антител инкубировать в темноте в течение 40-60 мин, периодически встряхивая в течение коротких периодов времени при температуре 4 °C.
5. Добавьте 1 мл 1x раствора для промывки клеток 2 раза, центрифугируя клетки при 400 × г в течение 5 минут при 4 °C; Затем выбросьте надосадочную жидкость.
6. Исследуйте клетки на проточном цитометре и проанализируйте данные с помощью программного обеспечения (рис. 3).
   1. Включите проточный цитометр и включите самозапускающийся процесс очистки и калибровки.
   2. Выберите лазерный канал, используемый в этом эксперименте, и установите чистую пробирку, одинарно окрашенные пробирки и пробирки для образцов.
   3. Нажмите на опцию «Пустая трубка » и проверьте на машине; Отрегулируйте напряжение таким образом, чтобы событие ячейки находилось, насколько это возможно, в центре ящика для сбора.
   4. Соберите одинарно окрашенные ячейки трубки и выполните спектральное обнаружение соответствующих каналов, чтобы подтвердить, что флуоресцентное антитело добавлено правильно.
   5. Нажмите кнопку «Отменить микширование » и позвольте машине автоматически настроить спектральную компенсацию. С помощью других приборов для проточной цитометрии отрегулируйте компенсацию флуоресценции в нормальном режиме.
   6. Соберите каждую ячейку для образца пробирки, сохраните формат данных в виде файлов FCS и экспортируйте. Анализируйте и стройте графики в соответствующем программном обеспечении для анализа данных проточной цитометрии.
      1. Обведите вокруг основной популяции клеток и удалите возможные клеточные адгезии через диагональные круговые ворота FSC-H и FSC-A.
      2. Обведите живые клетки в соответствии с областью отрицательного круга FVS; затем обведите популяцию клеток CD4+.
      3. Построить поперечные ворота с горизонтальной осью как ИЛ-17 А и вертикальной осью как RORγT; двойной положительный отбор в области Q2 представляет собой популяцию клеток Th17.

6. Иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления секреции IL-17A, индуцированной различными средами

1. Разморозьте надосадочную жидкость замороженных клеток, собранные в разделе 4.5.
2. Добавьте 100 мкл разбавленного стандарта, бланк и образец в предназначенные для этого лунки. Используйте герметик, чтобы накрыть планшет, и инкубируйте в течение 90 минут при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте растворы в нижнюю часть микро-ИФА лунки, не касаясь внутренней стенки и не вызывая пенообразования.
3. Сцедите жидкость из каждой лунки и немедленно добавьте 100 мкл рабочего раствора Biotinylated Detection Antibody. Используйте новый герметик, чтобы накрыть планшет, и инкубируйте в течение 1 часа при 37 °C.
4. Сцедите раствор и добавьте в каждую лунку по 350 мкл промывочного буфера. Через 1 минуту отасуньте или сцедите раствор из каждой лунки и промокните его насухо на чистой впитывающей бумаге. Повторите этот шаг стирки 3 раза.
5. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора конъюгата пероксидазы хрена. С помощью нового герметика накройте планшет и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 °C.
6. Сцедите раствор из каждой лунки и повторите процесс промывки 5 раз, как описано в шаге 6.4.
7. Добавьте 90 μL реагента Substrate в каждую лунку и инкубируйте около 15 минут при 37 °C с помощью нового герметика, защищающего планшет от света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время реакции может быть изменено в зависимости от фактического изменения цвета, но не должно превышать 30 минут. Дайте считывателю микропланшетов прогреться в течение ~15 минут перед измерением внешнего диаметра.
8. Добавьте 50 μл/лунку Stop Solution в том же порядке, что и раствор для субстрата.
9. Определите оптическую плотность (значение OD) каждой лунки сразу с помощью считывателя микропланшетов, установленного на 450 нм.
10. Получите значения наружного диаметра для стандартных образцов и повторите лунки образцов, а также вычтите значения наружного диаметра пустых лунок для получения скорректированных значений. Затем выполните линейную аппроксимацию с концентрацией в качестве абсциссы и значением OD в качестве ординаты. На основе подогнанного уравнения рассчитать значения концентрации Ил-17А для пробных скважин.
    Примечание: После 4 дней дифференцировки содержание IL-17A в надосадочной жидкости каждой группы показано на рисунке 4. Метод подгонки можно использовать в программном обеспечении Orgin21. Стандартная кривая, полученная в результате этого эксперимента, имеет значение R² 0,9946.

7. Дифференцировка Т-клеток с помощью анализов экспрессии сигнатурных генов с помощью количественной ПЦР (кПЦР)

Примечание: Чтобы исключить возможность нестабильности проточной цитометрии из-за эффектов красителей и фиксации/разрыва, мы обнаружили экспрессию характерных генов с помощью количественной ПЦР для выяснения эффекта дифференцировки патогенного Th17 на уровне транскрипции.

1. Измерьте количество клеток в конце культивирования Т-клеток. Соберите клетки в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируйте при давности 400 × г в течение 5 минут. Тщательно выбросьте все надосадочные жидкости.
2. Экстракция РНК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс экстракции должен проводиться в вытяжном шкафу или на сверхчистом столе, чтобы избежать загрязнения ферментами РНК.
   1. Добавьте 500 мкл буфера для лизиса (например, до 1-2 ×^{10 6} клеток) в пробирку с образцом (шаг 7.1), немедленно встряхните и перемешайте до тех пор, пока не останется клеточная масса, и дайте постоять 1 минуту.
   2. Добавьте смесь в адсорбционную колонну, помещенную в сборную пробирку, центрифугируйте при 13 400 × г в течение 30 с и выбросьте фильтрат.
   3. Добавьте указанное количество абсолютного этанола в бутылку Wash Buffer перед первым использованием. Добавьте 500 μL промывочного буфера в адсорбционную колонну, центрифугируйте при 13 400 × г в течение 30 с и выбросьте фильтрат.
   4. Повторите стирку в шаге 7.2.3.
   5. Поместите адсорбционную колонку RA в пустую сборную пробирку и центрифугируйте при температуре 13 400 × г в течение 2 минут, чтобы удалить раствор для промывки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для полоскания необходимо удалить, чтобы остатки этанола в растворе для промывки не ингибировали реакцию на последующих этапах.
   6. Снимите адсорбционную колонку RA и поместите ее в чистую центрифужную пробирку без РНКазы. Добавьте 50 мкл не содержащего РНКазы H₂O в середину адсорбционной мембраны, дайте ей постоять 1 минуту при комнатной температуре и центрифугируйте при 9600 × г в течение 1 минуты.
3. Измерьте чистоту и концентрацию РНК.
4. Синтезируйте первую цепь кДНК, следуя инструкциям производителя набора.
   1. Удалите геномную ДНК. Возьмите 500 нг экстрагированной матричной РНК в центрифужную пробирку без РНКазы; добавьте смесь ddH,₂O и 4x gDNA, не содержащую РНКазы, чтобы получить смесь. Аккуратно взбейте пипеткой и поставьте на водяную баню при температуре 42 °C на 2 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество реакционной смеси и количество добавляемой зависят от концентрации РНК; Обратитесь к подробной инструкции. В эксперименте использовалась реакционная система объемом 20 μл.
   2. Непосредственно добавьте 5-кратную реакционную систему обратной транскрипции в реакционную пробирку предыдущего этапа. Возьмите 4 мкл реакционной системы обратной транскрипции и 16 мкл смеси с предыдущего этапа и аккуратно перемешайте пипеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система обратной транскрипции включает в себя все необходимые системы обратной транскрипции, которая представляет собой систему обратной транскрипции с прямой конфигурацией.
   3. Установите реакцию обратной транскрипции: 37 °C 15 мин, 85 °C, 5 с и, наконец, охладите до 4 °C.
5. Настройте реакцию ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
   1. Добавьте 10 мкл смеси ферментов реакции ПЦР 2x в пробирку для количественной ПЦР, 0,4 мкл праймера 1, 0,4 мкл праймера 2, 0,4 мкл 50x референсного красителя ROX 1, 2 мкл матричной кДНК и 6,8 мкл ddH₂O для получения смеси объемом 20 мкл.
   2. Провести ПЦР в приборе для флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени с использованием следующих настроек: стадия 1, 95 °C, 30 с, Rep x 1; ступень 2, сначала 95 °C, 10 с, затем 60 °C, 30 с, Rep x 40; стадия 3, первая 95 °C, 15 с, следующая 60 °C, 60 с, наконец 95 °C, 15 с, Rep x 1.
      Примечание: После 4 дней дифференцировки относительные уровни экспрессии Il17a, Il17f, Rora и Il23r в наивных CD4⁺ Т-клетках показаны на рисунке 5.

Discussion

Эта процедура предложила продуктивный способ увеличения количества CD4+ Т-клеток селезенки у мышей для производства in vitro патогенных Th17-клеток. Несмотря на то, что мы используем больше цитокинов, чем другие зарегистрированные среды для культивирования клеток Th17, мы стремимся оптимизировать условия роста патогенных клеток Th17. Мы рассматриваем дальнейшую оптимизацию нашего протокола индуцированной дифференцировки.

В данном случае мы просто использовали проточную цитометрию и кПЦР для изучения продукции цитокинов отличительного признака. С некоторыми незначительными изменениями этот подход также может быть использован для других функциональных тестов, таких как пролиферация клеток.

Мы использовали набор для выделения лимфоцитов китайского производства для выделения лимфоцитов селезенки мыши, потому что он эффективен и экономит время. Решения для разделения лимфоцитов на основе других брендов также могут достигать цели разделения лимфоцитов селезенки мыши с помощью различных этапов. Другой метод заключается в непосредственном лизировании эритроцитов полученной суспензии клеток селезенки; Тем не менее, мы обнаружили, что эритроциты селезенки часто не могут быть лизированы за один раз.

Во время выполнения этого протокола могут возникнуть некоторые проблемы. Во-первых, количество наивных CD4⁺ Т-клеток, полученных с помощью магнитной сортировки шариков, может быть очень низким (шаг протокола 3). Это может быть связано с тем, что процесс дробления органов является недостаточным. Важно следить за тем, чтобы орган был правильно гомогенизирован. Увеличение частоты промывки в процессе гомогенизации улучшит скорость восстановления. Для получения большего количества CD4⁺ Т-клеток, не относящихся к селезенке, мы предлагаем использовать более молодых мышей (в возрасте 6-10 недель). Существуют различные методы разделения лимфоцитов селезенки, и выход может варьироваться в зависимости от используемой жидкости для разделения. Рекомендуется использовать универсально сертифицированную разделительную жидкость и стараться максимально извлечь слой лимфоцитов.

Во-вторых, доля CD4⁺ Т-клеток в проточной цитометрии может составлять <80% (этап протокола 5). Одной из возможных причин этой проблемы может быть неточный подсчет спленоцитов, в результате чего количество клеток превышает количество клеток дополнительного коктейля антител и магнитных шариков. Чтобы повысить эффективность наивной очистки CD4⁺ Т-клеток, подсчет клеток должен быть точным. Кроме того, можно использовать на 10% больше коктейля антител и магнитных шариков сверх того, что рекомендует этот протокол. Наконец, проточная цитометрия может быть выполнена сразу после сортировки наивных CD4⁺ Т-клеток.

В-третьих, во время культивирования может образоваться не так много кластеров Т-клеток, и большинство клеток могло погибнуть во время дифференцировки Т-клеток (шаг 4 протокола). Потенциальной причиной этой проблемы может быть неточное определение количества клеток для наивных CD4⁺ Т-клеток до посева, что приводит к низкой плотности клеток. Рекомендуется использовать более точный метод подсчета для достижения желаемой плотности ячеек приблизительно 4 × 10⁵ клеток/мл для каждой лунки в 48-луночном планшете. Другой возможной причиной могут быть технические проблемы с инкубатором CO₂ , такие как неправильная температура или концентрация CO₂ . Наконец, чрезмерное усилие при смене среды для культивирования клеток потенциально может привести к гибели клеток.

В-четвертых, относительные уровни экспрессии генов сигнатурных цитокинов могут быть низкими (этап протокола 7). Чтобы обеспечить подлинность экстрагированной РНК, рекомендуется использовать концентрацию нанокапельного детектирования более 100 нг/мл. Потенциальной причиной снижения концентрации может быть нездоровый характер культивируемых клеток, например, большая часть собранных клеток мертва или находится в процессе гибели. Чтобы получить истинную концентрацию РНК, необходимо разрешить ситуацию, которая может привести к плохому росту во время культивирования клеток. Альтернативной причиной этого беспокойства может быть чрезмерно низкое конечное количество клеток, достигнутое во время экстракции РНК, возможно, из-за непреднамеренной потери клеток во время утилизации надосадочной жидкости. Использование передовых методов экстракции РНК, таких как наборы для одношаговой экстракции РНК, может оказаться выгодным. Идеальное соотношение OD260/OD280, измеренное с помощью Nanodrop, должно находиться в диапазоне 1,9-2,1. В случае чрезмерно низкого соотношения становится возможным заражение белков. Увеличение частоты промывки буфера без РНКазы может помочь смягчить эту проблему. И наоборот, нехарактерно низкое соотношение подразумевает потенциальную деградацию РНК. Чтобы противодействовать этой проблеме, рекомендуется использовать воду, не содержащую РНКазы, и использовать пробирки объемом 1,5 мл для обеззараживания РНКазы.

В заключение, текущий протокол описывает использование новой среды для культивирования клеток для непосредственного индуцирования наивных CD4⁺ Т-клеток к дифференцировке в патогенные клетки Th17 in vitro. По сравнению с прямым сепарированием, нет никаких сомнений в том, что этот метод является более прямым, недорогим и более эффективным. Конфигурация среды также очень проста, так что сконструированные клетки Th17 можно более интуитивно использовать для последующих экспериментов, обеспечивая очень хорошую модель клетки для изучения многих заболеваний.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Rat anti-mouse CD62L, BV650, clone MEL-14, 1:200 dilution	BD	Cat# 564108; RRID: AB_2738597
Rat monoclonal anti-CD4, FITC, clone RM4-5, 1:200 dilution	BioLegend	Cat#100509; RRID: AB_312712
Rat monoclonal anti-IL-17A, PE, clone TC11-18H10.1, 1:200 dilution	BioLegend	Cat#506903; RRID: AB_ 315463
Rat monoclonal anti mouse/human CD44, APC, clone IM&, 1:200 dilution	BioLegend	Cat#103012; RRID: AB_312963
Rat monoclonal anti-RORγT, APC, clone B2D, 1:200 dilution	Invitrogen	Cat#17-6981-80; RRID: AB_2573253
Rat monoclonal FOXP3 antibody, PE, clone FJK-16s, 1:200 dilution	Invitrogen	Cat#12-5773-82; RRID: AB_465936
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
Anti-Mouse CD3 SAFIRE purified	biogems	Cat#05112-25
Anti-Mouse CD28 SAFIRE purified	biogems	Cat#10312-25
Anti-Mouse IFN gamma	biogems	Cat#80822-25
Anti-Mouse IL-4	biogems	Cat#81112-25
Ethanol	Xilong scientific	Cat#64-17-5
Fetal bovine serum	Gibco	Cat#10437-028
FcR Blocking reagent	Miltenyi Biotec	Cat#130-092-575
GlutaMAX supplement	gibco	Cat#35050079
Mouse rIL-1 beta	Sino Biological	Cat#50101-MNAE
Mouse rIL-6	Sino Biological	Cat#50136-MNAE
Mouse rIL-23	Sino Biological	Cat#CT028-M08H
Mouse TGF beta 1	Sino Biological	Cat#50698-M08H
PBS	Procell	Cat#PB180327
Recombinant Murine IL-2	peprotech	Cat#212-12
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco	Cat#11875-119
Penicillin-streptomycin solution	Gibco	Cat#15070063
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	Cat#M6250-100ML
Critical commercial assays
Animal Organ Lymphocyte Separation Solution Kit	Tbdscience	Cat#TBD0018SOP	Contains animal spleen tissue lymphocyte separation liquid, tissue sample diluent (cat no. 2010C1119), sample cleaning solution (cat no. 2010X1118), sample washing solution (cat no. TBTDM-W), tissue homogenate flushing liquid (F2013TBD)
ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)	Vazyme	Cat#Q341-02	https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html.
Fixation/permeabilization Concentrate	invitrogen	Cat#00-5123-43
Fixation / Permeabilization Diluent	invitrogen	Cat#00-5223-56
Fixable Viability Dye EF506	invitrogen	Cat#65-0866
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	Cat#R223-01	https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html.
Leukocyte Activation Cocktail	BD	Cat#550583
Mouse IL-17A (Interleukin 17A) ELISA Kit	Elabscience®	Cat#E-EL-M0047
Naïve CD4+ T cells isolation kit, mouse	STEMCELL	Cat#19765	EasySep kit contains mouse CD4+ T cell isolation cocktail [cat no. 19852C.1], mouse memory T cell depletion cocktail [cat no. 18766C], streptavidin RapidSphered 50001 [cat no. 50001], normal rat serum [cat no. 13551]); only store rat serum at -20 °C; other components to be stored at 2-8 °C.
Permeabilization Buffer	invitrogen	Cat#00-8333-56
SPARKeasy Cell RNA Kit	Sparkjade	Cat#AC0205-B	https://www.sparkjade.com/product/detail?id=85
Experimental models: Organisms/strains
Mouse: C57BL/6	Gempharmatech	Cat#000013
Oligonucleotides
Mouse Il17a TaqMan primers with probe	ribobio	NA
Mouse Il17f TaqMan primers with probe	ribobio	NA
Mouse Il23r TaqMan primers with probe	ribobio	NA
Mouse Rora TaqMan primers with probe	ribobio	NA
β-actin TaqMan primers with probe	ribobio	NA
Software and algorithms
Cytek Aurora	Cytek	https://spectrum.cytekbio.com/
FlowJo v10.8.1	Tree Star	https://www.flowjo.com
GraphPad prism 9	GraphPad Software	https://www.graphpad-prism.cn
Other
1 mL syringe	Kindly	NA
1.5 mL Centrifuge tubes	Eppendorf	Cat#MCT-150-C
5 mL Round-bottom tubes	Corning	Cat#352235
15 mL Centrifuge tubes	NEST	Cat#601052
48-Well tissue culture plate (flatten bottom)	Corning	Cat#3548
50 mL Centrifuge tubes	NEST	Cat#602052
70 µm Cell strainer	Biosharp	Cat#BS-70-XBS
96-well Unskirted qPCR Plates	VIOX scientific	Cat#V4801-M
100 mm Petri dish	Corning	Cat#430167
Centrifuge	Eppendorf	5425R
Cell culture CO2 incubator	Thermo Fisher	HEPA Class100
Cytek Aurora	Cytek	NA
dissecting scissors	RWD	S12003-09
Hemocytometer	AlphaCell	Cat#J633201
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-2000
Real-time PCR System	Roche	LightCycler96
Surgical tweezers	RWD	F12005-10
Thermal cycler	Bio-Rad	C1000 Touch