שימוש באורגנואידים של המעי האנושי כדי להבין את אפיתל המעי הדק ברמת השעתוק של תא בודד

Summary

הפרוטוקול משלב טכנולוגיית אורגנואיד מעיים אנושיים עם ניתוח תעתיק של תא בודד כדי לספק תובנה משמעותית לגבי ביולוגיית המעי שלא נחקרה בעבר.

Abstract

תעתיק תא בודד חולל מהפכה בהבנתנו את הביולוגיה התאית של גוף האדם. תרביות אורגנואידים אנושיות חדישות במעי דק מספקות מערכות מודל ex vivo המגשרות על הפער בין מודלים של בעלי חיים לבין מחקרים קליניים. היישום של תעתיק תא בודד למודלים של אורגנואידים במעי אנושי (HIO) חושף ביולוגיה של התא, ביוכימיה ופיזיולוגיה של מערכת העיכול שלא היו מוכרים עד כה. פלטפורמות השעתוק המתקדמות של תא בודד משתמשות בחלוקה מיקרופלואידית וברקוד כדי ליצור ספריות cDNA. cDNA ברקודים אלה ניתנים לריצוף בקלות על ידי פלטפורמות ריצוף של הדור הבא ומשמשים כלי הדמיה שונים ליצירת מפות. במאמר זה אנו מתארים שיטות לתרבית ולהבחנה בין HIOs אנושיים במעי דק בפורמטים ונהלים שונים לבידוד תאים בני קיימא מתבניות אלה המתאימות לשימוש בפלטפורמות פרופיל שעתוק של תא יחיד. פרוטוקולים ונהלים אלה מאפשרים שימוש ב- HIOs של המעי הדק כדי להשיג הבנה מוגברת של התגובה התאית של אפיתל המעי האנושי ברמת השעתוק בהקשר של מגוון סביבות שונות.

Introduction

לאפיתל המעי הדק שני אזורים נפרדים: הקריפטה המאחסנת את תאי גזע המעי (ISC) והווילוס המורכב מתאים ממוינים של השושלות המפרישות והספיגה. למורכבות זו מתווספת הספציפיות האזורית של האפיתל המספקת תכונות פונקציונליות ייחודיות בין אזורי המעי הדק. עבודה חלוצית קבעה תנאי תרבית שבהם ניתן ליצור הן את קריפטת המעי הדק האנושית והן את אזורי הווילוס ex vivo מרקמות כירורגיות או ביופסיות רקמות¹. תרביות אלה מגשרות על הפער בין מחקרים בבעלי חיים לבין ניסויים קליניים וחושפות ביולוגיה של התא, ביוכימיה ופיזיולוגיה של מערכת העיכול שלא הוכרו עד כה. ה-HIOs מופצים כמבנים כדוריים תלת-ממדיים באמצעות מדיה עם גורמי גדילה המקדמים את יכולת הקיום של תאי גזע ומטריצות תמיכה ח....

Protocol

קווי האורגנואידים המשמשים כאן התקבלו מהמרכז הרפואי למחלות עיכול של טקסס GEMS Core. בקצרה, כדי להקים בתחילה קווי אורגנואידים, דגימות רקמת התורם נשטפו ועוכלו אנזימטית כדי לשחרר את קריפטים המעי. הקריפטות הוטמעו בקרום מרתף ותורבתו בתווך. ועדת הביקורת המוסדית במכללת ביילור לרפואה אישרה את פרוטוק?.......

Discussion

באמצעות פלטפורמות גנומיקה של תא בודד, ניתן לפרק מערכות ביולוגיות מורכבות, כגון תרביות HIO שמקורן ברקמה המדמה את אפיתל המעי, כדי להניב תרומות תאיות בודדות לתגובה ביולוגית כוללת ^4,5,6. ניתן לזהות ולחקור גם הטרוגניות תאית ואוכלוסיות תאים נדירו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM