Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול משלב טכנולוגיית אורגנואיד מעיים אנושיים עם ניתוח תעתיק של תא בודד כדי לספק תובנה משמעותית לגבי ביולוגיית המעי שלא נחקרה בעבר.

Abstract

תעתיק תא בודד חולל מהפכה בהבנתנו את הביולוגיה התאית של גוף האדם. תרביות אורגנואידים אנושיות חדישות במעי דק מספקות מערכות מודל ex vivo המגשרות על הפער בין מודלים של בעלי חיים לבין מחקרים קליניים. היישום של תעתיק תא בודד למודלים של אורגנואידים במעי אנושי (HIO) חושף ביולוגיה של התא, ביוכימיה ופיזיולוגיה של מערכת העיכול שלא היו מוכרים עד כה. פלטפורמות השעתוק המתקדמות של תא בודד משתמשות בחלוקה מיקרופלואידית וברקוד כדי ליצור ספריות cDNA. cDNA ברקודים אלה ניתנים לריצוף בקלות על ידי פלטפורמות ריצוף של הדור הבא ומשמשים כלי הדמיה שונים ליצירת מפות. במאמר זה אנו מתארים שיטות לתרבית ולהבחנה בין HIOs אנושיים במעי דק בפורמטים ונהלים שונים לבידוד תאים בני קיימא מתבניות אלה המתאימות לשימוש בפלטפורמות פרופיל שעתוק של תא יחיד. פרוטוקולים ונהלים אלה מאפשרים שימוש ב- HIOs של המעי הדק כדי להשיג הבנה מוגברת של התגובה התאית של אפיתל המעי האנושי ברמת השעתוק בהקשר של מגוון סביבות שונות.

Introduction

לאפיתל המעי הדק שני אזורים נפרדים: הקריפטה המאחסנת את תאי גזע המעי (ISC) והווילוס המורכב מתאים ממוינים של השושלות המפרישות והספיגה. למורכבות זו מתווספת הספציפיות האזורית של האפיתל המספקת תכונות פונקציונליות ייחודיות בין אזורי המעי הדק. עבודה חלוצית קבעה תנאי תרבית שבהם ניתן ליצור הן את קריפטת המעי הדק האנושית והן את אזורי הווילוס ex vivo מרקמות כירורגיות או ביופסיות רקמות1. תרביות אלה מגשרות על הפער בין מחקרים בבעלי חיים לבין ניסויים קליניים וחושפות ביולוגיה של התא, ביוכימיה ופיזיולוגיה של מערכת העיכול שלא הוכרו עד כה. ה-HIOs מופצים כמבנים כדוריים תלת-ממדיים באמצעות מדיה עם גורמי גדילה המקדמים את יכולת הקיום של תאי גזע ומטריצות תמיכה ח....

Protocol

קווי האורגנואידים המשמשים כאן התקבלו מהמרכז הרפואי למחלות עיכול של טקסס GEMS Core. בקצרה, כדי להקים בתחילה קווי אורגנואידים, דגימות רקמת התורם נשטפו ועוכלו אנזימטית כדי לשחרר את קריפטים המעי. הקריפטות הוטמעו בקרום מרתף ותורבתו בתווך. ועדת הביקורת המוסדית במכללת ביילור לרפואה אישרה את פרוטוק?.......

Representative Results

מתלים חד-תאיים אוחדו מ-2-3 בארות של תרבית תאים ממברנה, חד-שכבתית ותלת-ממדית HIOs כדי להבטיח תפוקת תאים מספקת ולהפחית את השונות בין תאים לבאר. ספריות תאים בודדים הוכנו באמצעות ריאגנטים ספציפיים לפלטפורמת פרופיל התא הבודד. ורצף עם קריאות קצה מזווג בפלטפורמת ריצוף של הדור הבא, 30,000 קריאות לתא. הקר?.......

Discussion

באמצעות פלטפורמות גנומיקה של תא בודד, ניתן לפרק מערכות ביולוגיות מורכבות, כגון תרביות HIO שמקורן ברקמה המדמה את אפיתל המעי, כדי להניב תרומות תאיות בודדות לתגובה ביולוגית כוללת 4,5,6. ניתן לזהות ולחקור גם הטרוגניות תאית ואוכלוסיות תאים נדירו?.......

Acknowledgements

המחברים מודים למענקי U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, מענקי U19 AI116497 והודעת הסכם שיתוף הפעולה של נאס"א / TRISH NNX16AO69A.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG914510 nM
0.05% Trypsin-EDTAInvitrogen25300054
0.4% Trypan blueMillipore-SigmaT8154
0.5 M EDTACorning46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-Corning21-040-CM
24 mm TranswellCostar3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dishThermo Scientific142475
40 µm cell strainerFalcon352340
40 µm Flowmi tip strainerSP Bel-Art LabwareH13680-0040
70 µm Flowmi tip strainerSP Bel-Art LabwareH13680-0070
96 well plateCorning3595
A-83-01Tocris2939500 nM
AccutaseStemCell Technologies7920
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
B27 supplementInvitrogen17504-0441X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.110x GenomicsPN-1000128
Collagen IVSigma-AldrichC5533-5MG33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution VWR354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 mM
HEPES 1MInvitrogen15630-08010 mM
L-WRN conditioned mediaATCCCRL-3276
Matrigel, GFR, phenol freeCorning356231
mouse recombinant EGFInvitrogenPMG804350 ng/mL
N2 supplementInvitrogen17502-0481X
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165-5G500 µM
NicotinamideSigma-AldrichN063610 mM
SB202190Sigma-AldrichS706710 µM
TranswellCorning3413
Y27632Stem Cell Technologies7230810 µM

References

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Blutt, S. E., et al. G....

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved