A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
הפרוטוקול משלב טכנולוגיית אורגנואיד מעיים אנושיים עם ניתוח תעתיק של תא בודד כדי לספק תובנה משמעותית לגבי ביולוגיית המעי שלא נחקרה בעבר.
תעתיק תא בודד חולל מהפכה בהבנתנו את הביולוגיה התאית של גוף האדם. תרביות אורגנואידים אנושיות חדישות במעי דק מספקות מערכות מודל ex vivo המגשרות על הפער בין מודלים של בעלי חיים לבין מחקרים קליניים. היישום של תעתיק תא בודד למודלים של אורגנואידים במעי אנושי (HIO) חושף ביולוגיה של התא, ביוכימיה ופיזיולוגיה של מערכת העיכול שלא היו מוכרים עד כה. פלטפורמות השעתוק המתקדמות של תא בודד משתמשות בחלוקה מיקרופלואידית וברקוד כדי ליצור ספריות cDNA. cDNA ברקודים אלה ניתנים לריצוף בקלות על ידי פלטפורמות ריצוף של הדור הבא ומשמשים כלי הדמיה שונים ליצירת מפות. במאמר זה אנו מתארים שיטות לתרבית ולהבחנה בין HIOs אנושיים במעי דק בפורמטים ונהלים שונים לבידוד תאים בני קיימא מתבניות אלה המתאימות לשימוש בפלטפורמות פרופיל שעתוק של תא יחיד. פרוטוקולים ונהלים אלה מאפשרים שימוש ב- HIOs של המעי הדק כדי להשיג הבנה מוגברת של התגובה התאית של אפיתל המעי האנושי ברמת השעתוק בהקשר של מגוון סביבות שונות.
לאפיתל המעי הדק שני אזורים נפרדים: הקריפטה המאחסנת את תאי גזע המעי (ISC) והווילוס המורכב מתאים ממוינים של השושלות המפרישות והספיגה. למורכבות זו מתווספת הספציפיות האזורית של האפיתל המספקת תכונות פונקציונליות ייחודיות בין אזורי המעי הדק. עבודה חלוצית קבעה תנאי תרבית שבהם ניתן ליצור הן את קריפטת המעי הדק האנושית והן את אזורי הווילוס ex vivo מרקמות כירורגיות או ביופסיות רקמות1. תרביות אלה מגשרות על הפער בין מחקרים בבעלי חיים לבין ניסויים קליניים וחושפות ביולוגיה של התא, ביוכימיה ופיזיולוגיה של מערכת העיכול שלא הוכרו עד כה. ה-HIOs מופצים כמבנים כדוריים תלת-ממדיים באמצעות מדיה עם גורמי גדילה המקדמים את יכולת הקיום של תאי גזע ומטריצות תמיכה ח....
קווי האורגנואידים המשמשים כאן התקבלו מהמרכז הרפואי למחלות עיכול של טקסס GEMS Core. בקצרה, כדי להקים בתחילה קווי אורגנואידים, דגימות רקמת התורם נשטפו ועוכלו אנזימטית כדי לשחרר את קריפטים המעי. הקריפטות הוטמעו בקרום מרתף ותורבתו בתווך. ועדת הביקורת המוסדית במכללת ביילור לרפואה אישרה את פרוטוק?.......
מתלים חד-תאיים אוחדו מ-2-3 בארות של תרבית תאים ממברנה, חד-שכבתית ותלת-ממדית HIOs כדי להבטיח תפוקת תאים מספקת ולהפחית את השונות בין תאים לבאר. ספריות תאים בודדים הוכנו באמצעות ריאגנטים ספציפיים לפלטפורמת פרופיל התא הבודד. ורצף עם קריאות קצה מזווג בפלטפורמת ריצוף של הדור הבא, 30,000 קריאות לתא. הקר?.......
באמצעות פלטפורמות גנומיקה של תא בודד, ניתן לפרק מערכות ביולוגיות מורכבות, כגון תרביות HIO שמקורן ברקמה המדמה את אפיתל המעי, כדי להניב תרומות תאיות בודדות לתגובה ביולוגית כוללת 4,5,6. ניתן לזהות ולחקור גם הטרוגניות תאית ואוכלוסיות תאים נדירו?.......
למחברים אין ניגודי עניינים.
המחברים מודים למענקי U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, מענקי U19 AI116497 והודעת הסכם שיתוף הפעולה של נאס"א / TRISH NNX16AO69A.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | 10 nM |
0.05% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
0.4% Trypan blue | Millipore-Sigma | T8154 | |
0.5 M EDTA | Corning | 46-034-CI | |
1x PBS Ca- Mg- | Corning | 21-040-CM | |
24 mm Transwell | Costar | 3412 | |
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
40 µm Flowmi tip strainer | SP Bel-Art Labware | H13680-0040 | |
70 µm Flowmi tip strainer | SP Bel-Art Labware | H13680-0070 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
A-83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1X |
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000128 | |
Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | 33 µg/mL |
Corning Cell Recovery Solution | VWR | 354253 | |
DPBS (Mg2-, Ca2-) | Invitrogen | 14190-136 | 1X |
GlutaMAX-I | Invitrogen | 35050-061 | 2 mM |
HEPES 1M | Invitrogen | 15630-080 | 10 mM |
L-WRN conditioned media | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel, GFR, phenol free | Corning | 356231 | |
mouse recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | 50 ng/mL |
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1X |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | 500 µM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 10 µM |
Transwell | Corning | 3413 | |
Y27632 | Stem Cell Technologies | 72308 | 10 µM |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved