Использование органоидов кишечника человека для понимания эпителия тонкой кишки на уровне транскрипции отдельных клеток

Summary

Протокол сочетает в себе технологию органоидов кишечника человека с транскриптомным анализом отдельных клеток, чтобы обеспечить значительное понимание ранее неизученной биологии кишечника.

Abstract

Транскриптомика одиночных клеток произвела революцию в нашем понимании клеточной биологии человеческого организма. Современные культуры органоидов тонкого кишечника человека обеспечивают модельные системы ex vivo , которые устраняют разрыв между животными моделями и клиническими исследованиями. Применение транскриптомики одиночных клеток к моделям кишечных органоидов (ГИО) человека раскрывает ранее непризнанную клеточную биологию, биохимию и физиологию желудочно-кишечного тракта. Передовые платформы транскриптомики одиночных клеток используют микрофлюидное разделение и штрихкодирование для создания библиотек кДНК. Эти кДНК со штрих-кодами могут быть легко секвенированы платформами секвенирования нового поколения и использованы различными инструментами визуализации для создания карт. В данной работе мы описываем методы культивирования и дифференциации ГИО тонкого кишечника человека в различных форматах и процедуры выделения жизнеспособных клеток из этих форматов, которые подходят для использования в платформах профилирования транскрипции одиночных клеток. Эти протоколы и процедуры облегчают использование ГИО тонкого кишечника для получения более глубокого понимания клеточного ответа эпителия кишечника человека на транскрипционном уровне в контексте различных сред.

Introduction

Эпителий тонкой кишки имеет две четко выраженные зоны: крипту, в которой находятся кишечные стволовые клетки (ISC), и ворсинки, которые состоят из дифференцированных клеток секреторной и абсорбционной линий. К этой сложности добавляется региональная специфичность эпителия, которая обеспечивает уникальные функциональные свойства между областями тонкой кишки. Новаторская работа позволила создать условия культивирования, в которых как крипта тонкой кишки человека, так и зоны ворсин могут быть созданы ex vivo из хирургических тканей или биопсии тканей¹. Эти культуры преодолевают разрыв между исследованиями на животных и клиническими испыта....

Protocol

Используемые здесь линии органоидов были получены из Центра заболеваний пищеварительной системы Техасского медицинского центра GEMS Core. Вкратце, чтобы первоначально установить органоидные линии, образцы донорских тканей промывали и ферментативно переваривали для высвобождения кишеч.......

Discussion

Используя платформы геномики отдельных клеток, сложные биологические системы, такие как тканевые культуры HIO, моделирующие кишечный эпителий, могут быть расщеплены для получения индивидуального клеточного вклада в общий биологический ответ ^4,5,6

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM