Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

本文概述了低双翅目蝇 Bradysia （Sciara） coprophila 的实验室维护（包括交配和喂养）。

Abstract

低双翅目蝇 Bradysia （Sciara） coprophila 的实验室种群已经维持了一个多世纪。此处介绍了 嗜粪芽孢杆菌 的实验室维护方案。这些方案将有助于迅速增加的研究 嗜盲芽孢杆菌 的实验室利用其独特的生物学特征，其中包括 （1） 雄性减数分裂 I 中的单极纺锤体;（2） 雄性减数分裂 II 中 X 二元组不分离;（3） 染色体印记以区分母系和父系同源物;（4） 生殖系限制性 （L） 染色体;（5） 染色体消除（雄性减数分裂 I 中的父系染色体;早期胚胎中的一到两条 X 染色体;来自早期胚胎胞体的 L 染色体）;（6） 母亲决定性别（没有 Y 染色体）;（7） 幼虫唾液腺多线染色体中 DNA 泡芙位点的发育调节 DNA 扩增。

现在，通过使用 嗜粪芽孢杆菌 基因组测序和组装的最新进展以及基因组工程转化方法的开发，可以探索染色体力学的这些独特特征。使用 B. coprophila 进行研究的不断增长的科学界将受益于此处描述的苍蝇交配方案（仅生儿子或独生女的母亲的表型标记;生化实验的大规模交配细节）、检查胚胎孵化、喂养幼虫以及对其饲养的其他评论。

Introduction

要全面了解生物学原理，需要研究跨越生命之树的许多不同生物。尽管到 19世纪末 描述了广泛的生物体，但到 20世纪 中叶，实验研究仅限于少数不到十几种模式生物。随着基因组时代的到来以及对生命之树1 中所有物种的基因组进行测序的目标，我们现在能够扩大用于实验室实验的生物类型，并利用其多样性的优势。这种对新兴模式生物进行实验的扩展具有能够在实验室中维护它们的先决条件。在这里，描述了饲养一种这种新兴新/旧模式生物的方案。

地球上的大部分动物生命是由 Insects2 的四种超级辐射构成的。在昆虫中，大约有 158,000 种双翅目（真苍蝇）3，其中大约 3000 种属于 Sciaridae（黑真菌蚊蚋）4。果蝇果蝇是双翅目果蝇中研究最彻底的。低级双翅目果蝇 （Nematocera），Bradysia（以前称为 Sciara）coprophila，在 2 亿年前与果蝇分化，果蝇是一种“高级双翅目”苍蝇 （Brachycera）。因此，嗜黑双歧杆菌处于与黑腹果蝇比较研究的有利分类位置（图 1）。此外，嗜粪芽孢杆菌具有许多独特的生物学特征，本身就值得研究 5,6,7。其中许多特征违反了 DNA 恒定性规则，在该规则中，生物体的所有细胞都具有相同的 DNA 含量。在 B. coprophila 中，（i） 在雄性减数分裂 I 中，父系基因组在单极纺锤体上被消除;（ii） 雄性减数分裂 II 中存在 X 二元组不分离;（iii） 从体细胞中消除生殖系限制性 （L） 染色体;（iv） 根据个体的性别，在早期胚胎中消除一条或两条 X 染色体。用于区分母系和父系同源物的染色体印记首先在 B. coprophila 中发现，并在许多这些染色体消除事件中发挥作用。除了染色体消除外，DNA 恒定性的另一种旁路是通过幼虫唾液腺多线染色体中 DNA 泡芙位点的发育调节、基因座特异性 DNA 扩增发生的。这些独特特征的研究需要对嗜酸芽孢杆菌进行实验室维护;这里介绍其饲养的详细信息，以促进此类研究。

figure-introduction-1302
图 1： Bradysia （Sciara） coprophila 的系统发育。 流行的模式生物以蓝色字体表示，它们的分类顺序以红色字体表示。 Bradysia 和其他 Sciarid 真菌蚊蚋以及蚊子是低级双翅目苍蝇（以前是 Nematocera 亚目），而 果蝇 物种是高等双翅目蝇（亚目：Brachysera）。图左侧的信息来自 Misof 等人 33;右侧的信息来自 Bertone 等人 34 和 Wiegmann 等人 2。 请单击此处查看此图的较大版本。

以前，Sciara 属在所有真核生物中拥有最多的物种 （700），促使 Steffan 将它们细分为8 种。随后，Shin 提议将 Sciaridae 科细分为 Sciarinae 亚科（有六个属，包括 Sciara、Trichosia 和 Leptosciarella）、Megalosphyinae 亚科（包括 Bradysia 属）和其他三个组（包括 Pseudolycoriella）9。近年来，几个小组进一步研究了 Sciaridae 的系统发育 9,10,11。在过去的几十年里，Sciaridae 家族中许多生物的名称发生了变化12.尽管跨越一个多世纪的大多数文献都将我们研究的生物体称为 Sciara coprophila，但它目前的分类学名称现在是 Bradysia coprophila（同义 Bradysia tilicola 和其他同义词）10。它们分布于世界各地，通常被称为真菌蚊蚋，因为它们吃蘑菇和其他真菌。它们于 1804 年由欧洲的 Meigen13 首次描述，随后由北美的 Johannsen 14,15 描述。B. coprophila 是在冷泉港实验室收集的，实验室库存是由 Charles Metz 在 1900 年代初期建立的，当时他还是哥伦比亚大学的研究生，师从托马斯·亨特·摩根 （Thomas Hunt Morgan）。因此，目前的种群反映了一个世纪的近亲繁殖。同样，Helen Crouse（她与 Barbara McClintock 一起完成博士工作）数十年的细胞遗传学研究进一步阐明了嗜粪芽孢杆菌的生物学特性。

在 1930 年代，Bradysia （Sciara） 与黑腹果蝇竞争作为遗传研究的模型系统。尽管具有许多独特的生物学特征，但嗜黑腹果蝇 （B. coprophila） 作为一种流行的模式生物被嗜黑腹果蝇所掩盖，因为遗传研究需要辐射诱导的表型突变，并且在后者中更容易实现，尽管嗜黑果嗜血杆菌对 γ 照射的抵抗力仅比嗜黑腹果蝇 （D. melanogaster） 略高 16。在基因组学的现代时代，这不再是一个问题。由于嗜粪芽孢杆菌的基因组序列 17,18,19（Urban、Gerbi 和 Spradling，数据未显示）和转化方法20,21（Yamamoto 和 Gerbi，数据未显示）最近已经可用，现在是时候将其用作新的/旧的新兴模型系统了，正如越来越多的科学家社区所看到的那样，他们已经将其用于研究。本文介绍了其实验室维护的程序。

B. coprophila 缺乏 Y 染色体，后代的性别由母亲决定。具有 X'（“X-prime”）染色体且具有长近着丝粒倒置的女性将仅生育女儿，而标准（非倒置）X 染色体纯合子的女性将仅生育5 个儿子（图 2）。X'19 号染色体的序列信息是可用的，但 X' 染色体如何决定后代将是女性的分子机制仍有待阐明。雄性从来没有 X' 染色体，受精后，雌性是 X'X（X' 的杂合子）或 XX。成年 X'X 雌性可以通过翅膀上的表型标记与 XX 雌性区分开来（图 3）。X'X 雌性（将只生女儿）可以通过 X' 上占主导地位的波浪形 （W） 翅标来识别（如 HoLo2 库存）22。或者，XX 雌性（将只有儿子）可以通过 X 上的隐性娇小 （p） 翅标来识别，如 91S 股票23。在这种情况下，X'Xp 雌性将具有全长（不是娇小）的翅膀，并且只有女儿。原种 6980 在 X 染色体上带有一个用于肿胀 （sw） 静脉24 的隐性标记，以及 X' 上的主要标记 Wavy，允许两个标记用于选择杂交。Wavy 的表达程度可能会有所不同，并且在食物受限或温度过高的过度拥挤的小瓶中似乎较弱。如果将幼虫保存在冷藏室 （4°-8 °C） 而不是通常的 21 °C 中，则波浪翼表型非常强。 虽然隐性娇小翅膀标记不是可变的并且很容易识别，但 91S 股票的使用频率较低，因为它们不如 HoLo2 股票健康。这里介绍了嗜粪菌 B. coprophila 的交配方案（图 2），并详细描述了 HoLo2、7298 和 W14 种群（补充文件 1）、91S 种群（补充文件 1）、6980 种群（补充文件 1）和易位种群（补充文件 1）。易位种群已不复存在;它们是异色粒 （H1、H2 和 H3） 在包含核糖体 RNA 基因 25,26,27 的短臂上的互易位。

figure-introduction-4836
图 2： 嗜粪芽孢杆菌的交配方案。 这种生物体没有 Y 染色体（雄性胞体只有一个 X）;母亲决定后代的性别。XX 个母亲只有儿子，X'X 个女性只有女儿。与 X 染色体相比，X' 染色体具有较长的近着丝粒倒置。X （或 X'） 染色体的父系或母系谱系在此图中分别用蓝色或红色表示。精子是常染色体的单倍体，但由于减数分裂 II 中的不分离，精子具有两个 X 染色体副本。早期胚胎的体细胞谱系会分别消除一个或两个父系衍生的 X 拷贝，如果它们是女性或男性。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-introduction-5385
图 3： 嗜红芽孢杆菌的翅膀表型。 成年雌性果蝇具有各种翅膀表型：（A） 直翅 （XX），（B） 波浪形翅膀 （X'WX），（C） 极端波浪形翅膀 （X'WX） 表型，在将幼虫储存在寒冷的roo m 中后外观干瘪，（D） 娇小的翅膀 （XpXp） 退化样，（E） 直翅，野生型 （XX） 且没有肿胀的叶脉， （F） 静脉肿胀的直翅 （XswXsw），其中小气泡（黑色箭头）出现在翅膀的上边缘和/或两个翅膀的尖端附近，（G） 肿胀的极端例子，一个或两个翅膀上出现水泡（白色箭头）。雄性没有 X' 染色体，因此永远不会有波浪形的翅膀，但它们分别在 91S 或 6980 库存中有娇小或肿胀的翅膀。比例尺 = 1 毫米。 请点击此处查看此图的较大版本。

存货维护的目标是进行杂交，其中一半的杂交来自产母的母牛，一半的杂交产母的母牛，以便在下一代中产雌母的成年母牛和成年雄牛的数量相等，用于后续的杂交。然而，这也涉及计划，因为雄性的生命周期比雌性短，而且成年雄性比成年雌性早一周出现。大自然通过让雄性胚胎在同一日期从杂交中从雌性幼虫中出来 1-2 天作为幼虫出现来适应这种性别之间的异步。然而，为了确保雄性和雌性成虫同时可用于实验室杂交，通过将带有雌性幼虫的小瓶放在室温而不是 21 °C 或将带有雄性幼虫的小瓶放置在稍低的温度（例如，16 °C）中，可以在一定程度上加快雌性幼虫的发育。另一种更万无一失的方法是在周一与女性生产者母亲进行杂交，在同一周的周五与男性生产者母亲进行杂交。最简单的方法，也是我们采用的，是在每周的同一天与女性生产者和男性生产者的母亲进行杂交，并在每周的同一天进行杂交。在这种方法中，第 1 周杂交的成年雌性可以与第 2 周杂交的成年雄配。

在 21 °C 下饲养时，雌性 嗜粪芽孢杆菌 的生命周期为 5 周（表 1）。在较低的温度下或如果它们喂养不足，它们的生命周期长度会更长一些。雄性嗜 粪 菌的生命周期为 ~4-4.5 周，因为它们比雌性早 0.5-1 周化蛹。每个幼虫龄期的末端以角质层脱落为标志，这是由类固醇激素蜕皮激素水平的爆发触发的。与具有 3 个幼虫龄的 D. melanogaster 不同， B. coprophila 有 4 个幼虫龄。

发育阶段配接后天数 （dpm）阶段长度（天）
产蛋1-2
胚胎1-2 至 7-8~7 天
幼虫
幼虫龄 1、2 和 37-8 至 16-19~10
第 4 幼虫龄前眼点16-19 至 21-245
第 4 幼虫龄眼点期21-24 至 25-284
蛹25-28 至 30-335
成人如果交配，在 21 °C 下可存活 1-2 天，如果不交配，在 16 °C 下可存活 2-3 周。

表 1：21 °C 下 雌性嗜红芽孢杆菌 的生命周期。

B. coprophila 可以保存在 15 °C-25 °C 范围内的任何温度，在较冷的温度下发育进展较慢。这种昆虫喜欢潮湿的环境（在室内植物或蘑菇床的土壤中发现），因此我们在培养箱中放置了一个装有去离子水的烧杯。 嗜酸芽孢杆菌 可以在室温下保存在金属面包盒中，该面包盒带有松散的盖子并装有水杯，但它们在 37 °C28 时会发生热休克，这在炎热的气候下是很危险的。Michael Ashburner 和其他人曾尝试将 黑腹果蝇 冷藏，以减少库存所需的时间，但收效甚微。相比之下， 嗜粪芽孢杆菌 的一个主要优点是，带有中期幼虫的小瓶可以在冷藏室 （4-8 °C） 的开放式架子上储存长达 3 个月，只需每月饲喂一次。它们在寒冷中发育极其缓慢，直到蛹期，当小瓶恢复到 21 °C 时，它们会成为可育的成虫。 据推测，这模仿了它们在野外越冬。这种寒冷诱导的发育停滞可能与中期 嗜粪芽孢杆菌 幼虫16 的伽马射线照射后看到的情况相当，但在已经过了正常发育进程不归路的晚期幼虫中看不到发育停滞。

Protocol

此处描述的协议代表了 Bradysia （Sciara） 种群中心一个世纪的经验，依次由 Charles Metz、Helen Crouse 和 Susan Gerbi 监督，以及其他人的意见。

1. 交配杂交

  1. 每 28 mm 直径玻璃样品瓶使用 1 只成年雌性和 2 只成年雄性。一旦在识别只有女儿或儿子的母亲的翅膀表型方面取得了 100% 的成功，每个小瓶使用两只雌性和两只雄性来增加幼虫/小瓶的数量。在添加比女性更快地从麻醉中醒来的男性之前，将女性添加到每个小瓶中。
    注意：下面的描述假定您有 CO2;或者，乙醚可用于麻醉成年果蝇。
  2. 如果使用乙醚麻醉成年苍蝇，请将折叠的实验室湿巾（例如 kimwipes）贴在 Coplin 罐的圆形玻璃盖内侧，并使用滴管从瓶子中转移一些乙醚以润湿实验室擦拭垫（但不饱和且太湿，乙醚液体会从其上掉下来并有淹死苍蝇的风险）。对于下面的步骤 1.6，将湿润的乙醚垫放在打开的小瓶顶部 ~1 分钟，直到成虫停止移动。一旦将成虫转移到白色瓷砖板上（使用代替白色苍蝇垫），定期（当苍蝇的腿开始抽搐时）将刚沾过乙醚的垫子放在（不要接触）板上的苍蝇上 ~1 分钟。
    注意： 乙醚易燃，应存放在通风罩中，而不是冰箱中。
  3. 在伸手可及的地方布置一个装有成年雌性小瓶的托盘、一个装有成年雄性的托盘和一盘含有 2.2% （wt/vol） 琼脂的空小瓶。在实验室工作台上，放置标语牌注释，说明“雌性”或“雄性”以及母亲的翅膀表型，以便选择用于杂交的成虫的小瓶将被放入正确的组中，其中一组中的所有小瓶将只有雄性后代，而另一组中的所有小瓶将只有雌性后代。
    注：确保样品瓶内没有冷凝液滴，因为成虫会粘附在液滴上。如果小瓶储存在塑料盒中，请在使用前将小瓶在室温下放在实验室工作台上至少 1 小时，以让冷凝水蒸发。
  4. 打开 CO2 气体和解剖显微镜的灯。
    注意：首选带有光纤的光源，因为它散发的热量较少，这会导致被麻醉的苍蝇更快地醒来。
  5. 用橡胶垫用成人用力敲击小瓶，使成虫落到小瓶底部并取下塞子;插入 CO2 喷枪喷嘴并装回塞子。
  6. 按下喷嘴触发器，使 CO2 流入小瓶 ~1 分钟以麻醉成人。
  7. 将脚放在脚踏板上，使 CO2 流到白色飞垫上，而不是喷枪喷嘴上。当苍蝇在白色飞垫上时，保持脚踏板处于踩下状态（或者每当苍蝇的腿开始抽搐时，间歇性地踩下脚踏板）。
  8. 从小瓶中取出喷嘴和塞子，然后在解剖显微镜下将小瓶倒置在白色飞垫上。
  9. 将倒置的小瓶底部敲击显微镜，使成虫从小瓶中落到白色的飞垫上。
  10. 选择最胖的成鱼（最近用白色腹部闭合），并使用细尖镊子轻轻地抓住成鱼的中腿或后腿。不要伤害用于交配舞蹈的前腿。不要使用刚刚闭合且身体完全白色且尚未变黑的成虫，因为它们的翅膀会很短且未完全发育，因此无法对翅膀表型进行评分。腹部较苗条的成年人仍然可以使用，尽管他们的生育能力有所下降。不要使用翅膀垂直抬起远离身体的瘦小成虫，因为它们已经死了。
  11. 用另一只手从装有 2.2% （wt/vol） 琼脂的小瓶中取出塞子。用与成虫一起握住镊子的手，用镊子用力敲击小瓶的顶部内壁，使成虫落到小瓶的底部。将塞子装回样品瓶中。
  12. 重复上述步骤 1.5-1.11 以设置每个包含成年女性的小瓶。使用画笔将未使用的苍蝇从白色苍蝇垫扫回其母瓶中。在母样品瓶的标签上打勾，以表明它已用于交配（尽管如果需要，可以再次使用）。
  13. 对于常规库存维护，设置6-8个小瓶，其中女性生产者母亲和6-8小瓶男性生产者母亲（图4）。用一个成人小瓶的母亲（或父亲）设置一半的小瓶，使用不同的成人小瓶设置新小瓶的另一半，以最大限度地减少遗传瓶颈。
    1. 有时，错误分离事件会在生产雌性样品瓶中产生异常的雄性样品瓶。如果装有成年雌性的小瓶中有一个特殊的雄性，请取出并挤压以杀死该雄性。如果可能，丢弃该小瓶中的所有雌性，并等待几天，直到更多的成年雌性闭合并可以安全地用于杂交。
      注意：最好不要使用该小瓶中的雌性进行杂交，因为它们可能已经与特殊的雄配，而不会产生可育的杂交。
  14. 将成年雌性添加到所有小瓶中后，重复步骤 1.5-1.11，将两个成年雄性（图 4）添加到每个已经含有雌性苍蝇的小瓶中。在橡胶垫上敲击带有母头的小瓶，以便在依次添加两个头顶时它们不会逃脱。
    注意：快速工作，不要过度麻醉成年苍蝇，因为这会杀死它们。
  15. 在每个样品瓶上添加标签，说明原液、杂交（对于雌性或雄性后代）、母亲是否来自成年样品瓶 #1 或 #2，以及交配日期。此外，将上述信息输入到笔记本中，并说明为每个交叉设置的样品瓶数量。
    注：在托盘中，添加纸巾以将生产阳样品瓶与生产内螺纹的样品瓶分开非常方便。
  16. 将小瓶在台面上不受打扰地放置 ~15 分钟，以确保成虫醒来并飞来飞去。观察它们是否正在交配（在它们醒来后不久），雌性和雄性的方向是从后到后（雄性扣子会抓住雌性的尖产卵器）（图 4，底部）。
    注意：成年雌性只会接受成年雄性一次，因此交配后不要推挤小瓶，因为这可能会在交配过程中将雄性与雌性分开，并且雌性不会再次交配。
  17. 将装有配套样品瓶的托盘放入培养箱中（例如，21 °C）。在托盘上贴上原液名称（例如 HoLo2）和 5 周周期的周（第 1、2、3、4 或 5 周）。
    注意：将装有刚交配的果蝇的托盘放在培养箱的单独部分或其他培养箱中，以提醒在幼虫出现之前不要喂食小瓶（如下所述）。

2. 批量配接

注意：通常，一个嗜 红芽孢杆菌 的母亲在她的育雏中会有 60 个后代。当实验需要大量的后代时，可以进行大规模交配，而不是上述单对交配。可以在直径为 28 厘米的标准玻璃瓶中进行大规模交配，一天后收集母亲用于诱导产卵和胚胎收集。然而，如果需要更多的幼虫，则在表面较大的罐子中进行大规模交配，以防止过度拥挤。在罐盖上刺几个小孔，以便幼虫可以获得一些空气呼吸。

  1. 按照上述第 1 节中的步骤操作，但使用细尖镊子将所有女性生产者母亲（或所有男性生产者母亲）移动到白色飞垫的前角。使用 10-15 名麻醉的脂肪成年女性，用画笔将这组扫入盖子上刺穿小孔的小瓶或罐子中。
    注意： 执行步骤 2.1 和 2.2。快速进行大规模交配，以避免过度麻醉，从而阻止可育杂交。
  2. 选择 20-25 只麻醉的脂肪成年雄性，并用细尖镊子将它们移动到白色飞垫的前角。
  3. 用橡皮垫用力敲击带有雌性的小瓶或罐子，这样当取下塞子或盖子以使用画笔从白色飞垫中扫入麻醉的成年雄性簇时，它们就不会逃脱。

3. 大规模交配后的胚胎收集

  1. 交配后一天（24 小时），执行步骤 1.5-1.11 麻醉成年苍蝇（雌性和雄性混合物）并将它们转移到白色苍蝇垫上。
    注意：当成蝇交配时，卵子发生尚未完成，这会触发完成减数分裂;当卵子排出时，成熟的卵子与储存在精子中的精子受精 29.完成卵子发生可能需要 1-2 天，这就是为什么在交配后允许 1 天才能诱导产卵。
  2. 用细尖镊子，抓住成年雌性的翅膀，将她放在直径为 100 毫米的培养皿上，其中含有 2.2% （wt/vol） 琼脂，将她的翅膀插入琼脂中。对白色飞垫上的每只成年雌性依次重复此步骤。丢弃蝇垫上的成年雄性。
  3. 一旦所有雌性果蝇都被琼脂刺穿，用镊子轻轻挤压头部诱导产卵，直到雌性果蝇出现类似癫痫发作的运动。或者，轻轻挤压她的胸部。然后她将在 30-60 分钟内产下一簇受精卵。用沾有水的实验室湿巾润湿培养皿的盖子盖住培养皿，以防止鸡蛋静电吸附到盖子上。

4. 检查幼虫的“孵化”

  1. 交配后 1 周检查幼虫的 “孵化”;从小瓶中取出塞子，并使用解剖显微镜对幼虫进行评分。他们的黑色下巴会反复张开和关闭，并会慢慢向前移动。如果只有少量幼虫，请在样品瓶标签上写上“少数”，以提醒减少该样品瓶的喂食量。用该十字检查托盘中的每个样品瓶，并在笔记本中输入带有幼虫的小瓶数量，该列位于该配对中设置的样品瓶数量旁边。
    注意：深黄色的鸡蛋不会发育。白色的卵很可能会发育，在幼虫出现前 1 天，黑色色素（未来的下巴）会在卵的前端发育。不要将末端以黑色球体结尾的白色细丝的霉菌误认为是幼虫——霉菌不会移动，这与在琼脂上向前爬行的幼虫不同。
  2. 向每个装有幼虫的小瓶中加入一小块吸管（仅一次），以控制过多的湿度并为幼虫提供藏身之处。
  3. 将托盘移至装有前几周交配杂交的幼虫托盘的培养箱（例如，21°C），并开始用新出现的幼虫喂养小瓶（参见下面关于喂养的部分）。
    注意：一般来说，幼虫会在它们死去的母亲附近成簇出现，它们会开始吃掉她;据推测，这会将酵母从母亲的肠道转移到幼虫的肠道。您可以在幼虫出现的当天或之后的 2 天内开始摄食。注意：如果延迟喂食，幼虫会互相吃掉，每瓶只剩下一只脂肪幼虫！
  4. 继续检查每周 3 天尚未出现幼虫的小瓶。如果 7-10 天后没有幼虫出现，请丢弃小瓶或储存以用于小瓶清洗。

5. 制作食物

注意：所有食品成分都应不含农药！

  1. 用汤匙按体积测量以下成分，然后将它们放入金属或玻璃锅（例如，8 英寸 x 8 英寸的金属烤盘）中：4 份燕麦秸秆（8 汤匙），2 份香菇粉（4 汤匙），1 份菠菜粉（2 汤匙），1 份荨麻粉（2 汤匙）。用汤匙在锅中充分混合配料。
    注意：或者，可以只用 2 份菠菜粉或荨麻粉代替 1 份。
  2. 用铝箔盖住锅，并在干燥循环中高压灭菌 20-30 分钟。让它冷却至室温过夜或更长时间。
  3. 从锅中取出铝箔纸，打碎结块的消毒食品混合物，用汤匙研磨制成粉末状混合物。
  4. 加入 1 份（2 满汤匙）啤酒酵母，充分混合到高压灭菌的食物混合物中。
    注意：Brewer 酵母没有高压灭菌，因为这会杀死酵母。
  5. 将食物混合物转移到无菌的带盖罐中。
    注意：可以使用与用于批量配接相同类型的 240 mL 染色缸，上述配方将装满染色缸。同样，相同类型的消毒带盖罐应仅装满在铝箔覆盖的锅中高压灭菌的稻草。

6. 喂食

注意：根据幼虫的年龄和数量调整食物量。给有大量幼虫的罐子喂食，这些幼虫来自集体交配。将少量食物撒在装有幼虫的培养皿中，这些幼虫被储存几天以用于发育阶段。下面描述的饲喂方法是在 Charles Metz 29 的实验室中开发的，一个世纪以来，他的实验室以及 Helen Crouse、Susan Gerbi 和其他人都成功地使用了这种方法。

  1. 洗手并彻底冲洗以去除肥皂。
    注意：不建议戴手套，因为它们会降低手指调节每个小瓶食物量的感觉。
  2. 将装有吸管的带盖无菌罐和装有食物的无菌罐存放在保存幼虫的培养箱（例如，21°C）中。取下罐子的盖子，将一些食物倒入干净的碗（例如糖果盘）中，以便于取用;盖上装有剩余食物的罐子的盖子。将盛有食物的敞开碗放在金属或玻璃小托盘中;这将阻止螨虫或其他昆虫爬过托盘壁进入装有食物的碗。
  3. 在第二根和第三根手指之间（或拇指和第二根手指之间）捡起一些食物。用另一只手从托盘中取出一个小瓶并取下塞子，喂食时用手指握住塞子。检查小瓶中幼虫的年龄和数量，并通过旋转握住食物的两根手指将适量的食物倒入小瓶中。装有新出现幼虫的小瓶只需要几粒食物。装有较老幼虫的小瓶应在琼脂顶部覆盖一层薄薄的食物。
  4. 如果小瓶中有白色霉菌，请使用喷洒在实验室抹布上的 70% 乙醇擦拭干净的长金属探针（例如，用木柄），取下塞子，然后将干净的探针插入小瓶中，以敲击琼脂表面的霉菌。如果有很多霉菌，请旋转探针，将霉菌缠绕在探针周围，以将其从样品瓶中取出。不要打扰琼脂的顶部，因为幼虫生活在那里;只需加入少量食物，然后盖回小瓶中的塞子。在存放探针或用它清洁另一个样品瓶之前，用蘸有 70% 乙醇的实验室抹布将探针擦干净。
  5. 一旦托盘中的所有样品瓶都进样完毕，就放回培养箱中的托盘，并按照步骤 6.3 中取出下一个进样托盘。
  6. 喂食完成后，将碗中剩余的食物倒入先前消毒的罐子中，盖上罐子的盖子，并存放在培养箱中。

7. 在培养皿上收集幼虫或蛹

  1. 对于少量幼虫，使用已用 70% 乙醇擦拭的金属探针或刮刀挖入小瓶中琼脂的顶层，将粘附的琼脂与一些幼虫转移到直径为 100 mm 的无菌培养皿中，该培养皿一半装满 2.2% （wt/vol） 琼脂。
  2. 对于大量幼虫，沿小瓶底部的壁插入抹刀，以将琼脂塞从小瓶中伸出，并将其正面朝上存放在空的培养皿中。使用解剖显微镜在琼脂塞顶部找到幼虫，并用细尖镊子将它们转移到直径为 100 毫米的无菌培养皿中，该培养皿一半装满 2.2% （wt/vol） 琼脂。
  3. 使用解剖显微镜将带有细尖镊子的幼虫分类为相同发育阶段的组。
    注意：由于轻微的发育不同步，在含有 2.2% （wt/vol） 琼脂的培养皿板上将有几个不同的分选幼虫簇。
  4. 加入一小撒食物，将装有幼虫的培养皿放入培养箱中。每天将其取出，用解剖显微镜观察，以选择所需的发育阶段。
    注意：对于 DNA 扑查研究，早期眼点幼虫会经历 10x5、12x6、14x7 和边缘眼/下颌阶段，每个阶段需要 ~1 天 30,31。选择眼睛 1/4 至 1/2 充满色素的蛹，在蛹睾丸中具有减数分裂 I 和 II 阶段。

8. 幼虫的冷藏室

  1. 作为备用，在冷藏室中保存大约 4 瓶来自连续 2 周杂交的雌性幼虫和 4 瓶雄性幼虫。
  2. 对于备用储存，喂养 4龄 早期（眼点前阶段）的幼虫，并将它们放入冷藏室架子上的敞口托盘中;每月只给这些小瓶喂食一次。
  3. 2-3 个月后，从连续 2 周的交配杂交中取出 16 个小瓶（在日历上标记以提醒）;将它们放在培养箱（例如，21°C）中以正常喂养它们，并让它们发育成成虫用于杂交。
  4. 当小瓶从冷藏室中取出时，将一组带有早期 4龄 幼虫的新小瓶放入冷藏室中，以便这些小瓶始终可用作储备液的备用。
    注意：冷藏室储存后的生存能力尚未针对不同的发育阶段进行系统测试，但我们的经验表明，早期 4龄 幼虫的冷藏效果很好。

9. 西林瓶清洗

  1. 成虫死亡后（羽化后 ~2-3 周），从培养箱中取出小瓶，并将其置于 60-70 °C 下 1 小时以杀死任何残留的生物体。
  2. 取下棉塞并存放在塑料盒中。
  3. 用抹刀将琼脂塞从小瓶中刮入废液罐中。
  4. 将样品瓶浸泡过夜或浸入盘中的水中更长时间。
  5. 使用专门为此目的保存的试管刷（切勿用于装有化学品或肥皂的容器），并在流来的自来水下在小瓶中上下擦洗。将清洁后的样品瓶开口面朝下放入金属篮中。在篮子中装满清洗干净的样品瓶。
    注意：切勿在小瓶中使用肥皂，因为任何残留的肥皂都可能杀死 嗜粪芽孢杆菌。
  6. 在篮子中加入金属丝网盖，在将盖子固定到位的同时，倒置篮子，用去离子水填充所有小瓶。在仍将盖子固定到位的同时，倒置篮子以清空样品瓶中的去离子水。重复去离子水冲洗 4 次。
  7. 将装有清洁样品瓶的篮子放在纸巾或开放式网状平台（例如实验室推车）上晾干一夜或更长时间。将干燥的小瓶存放在抽屉中。
    注意：在清洗之前，不要让装有成虫死亡的小瓶放置太久，因为它可能会引起螨虫的侵扰。

10. 倾倒琼脂

  1. 用干净的样品瓶装满一个大容器（金属篮或金属托盘），并为每个样品瓶添加一个棉塞。重复使用清洗样品瓶时从旧样品瓶中取出的塞子，并反复使用塞子，直到它们降解并散开，应丢弃。用堵塞的小瓶在干循环中对容器消毒 ~30 分钟，然后让它们冷却至室温以储存在高压灭菌器容器中。始终保留两个容器（一个正在使用，一个备用），手头有高压灭菌的堵塞样品瓶。
  2. 将 11.0 g 琼脂粉放入 1 L 锥形瓶中，加入 500 mL 蒸馏水，制成 2.2% （wt/vol） 琼脂溶液，足以倒入 ~24 个小瓶（~21 mL/小瓶）。旋转烧瓶并将其放入微波炉中。
    注意：从这里开始，使用耐热高压灭菌手套来处理培养瓶。如果需要，可以将相同的 2.2% （wt/vol） 琼脂溶液倒入培养皿（用于挑取的幼虫）或罐子（用于大规模交配）中。
  3. 微波炉加热 1 分钟，取出烧瓶旋转，放入微波炉中，再次微波 1 分钟。重复此操作几次。
  4. 通过微波炉的玻璃门观察烧瓶。当琼脂溶液开始起泡和沸腾时，立即使用手动停止按钮。此时不要旋转烧瓶（它可能会沸腾），并小心地将其从烤箱中取出到柜台上，静置几分钟。
  5. 从消毒的小瓶中取出塞子并用一只手握住;用另一只手将 ~2.5 cm 高的 2.2% 琼脂倒入灭菌的小瓶中。然后，将塞子装回样品瓶中。重复此操作，直到倒出所有琼脂。
    注意：如果倒入小瓶中的琼脂太少，它在使用过程中会更快地变干并从小瓶壁上收缩。如果将过多的琼脂倒入小瓶中，则在用解剖显微镜对幼虫的“婴儿孵化”进行评分时，很难聚焦在顶层。
  6. 让倒出的小瓶在室温下在柜台上放置 1-2 天，以便琼脂变硬并且水分完全蒸发。将样品瓶用于交配十字架，或将它们侧放存放在带密封盖的塑料盒中;在将盖子盖到盒子上之前，将蘸有水的纸巾放在小瓶顶部（这将防止琼脂变干并从小瓶壁上收缩）。将装有倒入样品瓶的盒子在室温下存放几天，或在 4 °C 冰箱或冷藏室中存放长达 2 周。在使用储存的小瓶之前，请将它们从盒子中取出，并在室温下放在柜台上一两个小时，让冷凝水从小瓶内部蒸发（成年果蝇会粘在冷凝水上并淹死）。

11. 制作西林瓶塞

  1. 将干净的样品瓶放入 50 mL 聚苯乙烯泡沫塑料试管支架中（用力将试管放入，使其直立）。切下一方形粗棉布（2-4 层厚）并将其放在小瓶顶部。
  2. 将先前制作的塞子上的粗棉布碎片放在粗棉布上，以形成更厚的一层。将棉花放在粗棉布上，然后向下压入小瓶中，确保紧紧填满小瓶的顶部一英寸左右。
  3. 将粗棉布两端的顶部固定在一起，然后用绳子系好。剪掉多余的绳子和多余的粗棉布（留出足够的绳子尾部以保持系紧，并留出足够的粗棉布以舒适地抓住插头）。
    注意： 安装插头，使其紧密贴合。您应该能够用食指和食指将它们拉出，同时用一只手握住它们。如果通过塞子拿起样品瓶，样品瓶掉了出来，则说明样品瓶太松了。如果拉出时发出响亮的爆裂声，则可能是太紧了。如果太紧或塞子上有一层坚硬、干燥的琼脂，果蝇可能会窒息。如果塞子有点太松或从样品瓶的侧面滑落，可以在台面上轻敲，将其挤压成稍宽的尺寸。

12. 典型的每周时间表（为了获得最大的效率，请按列出的顺序执行任务）

  1. 周一 （~30 分钟）
    1. 用幼虫喂养小瓶。
    2. 将琼脂倒入带塞的无菌干净小瓶中。
  2. 星期三 （~2 小时）
    1. 将装有死成虫的小瓶放入烤箱中 1 小时并储存以备清洗。
    2. 检查幼虫的 “婴儿孵化”。
    3. 用幼虫喂养小瓶。
    4. 每周进行一次交配交叉。
    5. 根据需要执行其他任务：高压灭菌清洁带塞的样品瓶，以便根据需要储备供应;根据需要制作新食物和高压灭菌稻草;根据需要对食物和稻草进行高压灭菌罐。
  3. 周五 （~30 分钟）
    1. 检查幼虫的 “婴儿孵化”。
    2. 用幼虫喂养小瓶。

Representative Results

此处描述的方案已被证明在饲养 嗜红芽孢杆菌方面取得了成功。当选择最近封闭的脂肪成虫进行交配时（图 4），超过 90% 的杂交可以生育并产生后代。不同的种群确实会有所不同（表 2）。7298 原种（带有 Wavy 标记的 X' 染色体）是最健康的原种，但经历了一段下降期，这显然是由于 DNA 移动元件的激活产生了基因组重排32。HoLo2 原液代表源自 7298 的健康菌株，其中基因组重排显然已经稳定，并且它已经取代了原液中心的亲本 7298 原液。HoLo2 原液是用于对 嗜红芽孢杆菌 基因组进行测序的原液，也是各种实验室小组使用最广泛的原液。最近，HoLo2 果蝇的 CRISPR 诱变已被用于创建具有白色眼睛表型的 W14 原液，用于用荧光眼标志物进行转化（Yamamoto 和 Gerbi，数据未显示）。W14 菌株非常坚固。6980 枪托（波浪形机翼和肿胀的静脉标记）的强度稍逊一筹，而 91S 枪托（小翼标记）的强度甚至更低。

成功的杂交会产生胚胎（图 5）。胚胎在第 7 至第 9次 卵裂分裂时去除印记的父系 X 染色体。此外，在胚胎的第 5 至 第 6次 卵裂分裂时，生殖系限制的 L 染色体从体细胞谱系中被消除。胚胎以幼虫的形式出现，不应与也可能存在的霉菌混淆（图 6）。眼点（对成虫眼睛的眼球）出现在第 4 龄 幼虫的后半部分（图 7）。眼点的大小为 DNA puff 扩增的开始和进展提供了方便的表型标志物，这是已知的仅有的两个自然发生的发育调节位点特异性染色体内 DNA（基因）扩增的例子之一。随后，蛹发育，充满眼睛的色素量可以作为精子发生中减数分裂 I 和 II 的发育标志物（图 8），其在这些分裂中具有独特的染色体行为。

figure-representative results-1116
图 4： 嗜红芽 孢杆菌成蝇的交配。 上面板显示了 HoLo2 种群中的三种成年苍蝇：波浪翅膀的雌性产卵母（X'WX 成年雌性）、直翅的雄性产卵母（XX 成年雌性）和直翅的雄性（X0 成年雄性）。注意雌蝇后端的尖产卵器和雄蝇后端的钩状扣环。下面板显示了雄性和雌配，雄性扣子抓住了雌性的产卵器。精子将储存在女性的精子中，并在卵子排放到外部时使卵子受精。成虫的长度为 2.0 毫米（雄性），2.5 毫米（雌性）。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-representative results-1654
图 5：嗜粪芽孢杆菌胚胎。左上面板是在解剖显微镜中使用标准光的胚胎视图;合胞体细胞质中的细胞核显示为黑点。右图使用荧光显微镜观察碘化丙啶染色的胚胎细胞核。胚胎的平均长度为 200 微米，平均宽度为 150 微米。生殖细胞的细胞核聚集在胚胎的后极，如第 6 周期（胚胎向前倾斜）和第 7-9 周期所示，之后它们散布着体细胞核。体细胞谱系中的 L 染色体消除发生在卵裂分 5 或 6 中;体细胞谱系中的 X 染色体消除发生在第 7、8或 9裂解分裂。细胞化发生在第 11 周期的间期。左表显示了 22 °C 时每个分割周期的平均时间长度。 左侧的桌子和右侧的面板经 de Saint Phalle 和 Sullivan35 许可改编。请单击此处查看此图的较大版本。

figure-representative results-2350
图 6： 嗜粪芽孢杆菌 胚胎以幼虫的形式出现。 在产卵后死亡的成年雌性产卵器附近可以看到一簇胚胎（蓝色粗箭头）。产卵一周后，胚胎变成年轻的幼虫，其中几只幼虫用黑色箭头表示。新出现的幼虫在前端有一个黑色的下巴和一个半透明的身体。它们在琼脂表面的顶部移动，不应与不移动的霉菌混淆。插图显示一些霉菌，有一根白色细丝（红色箭头）和尖端的黑色孢子（绿色箭头），比新出现的幼虫略小。比例尺 = 1 毫米。 请点击此处查看此图的较大版本。

figure-representative results-2869
图 7： B. coprophila 幼虫的眼点阶段。 眼点形成于幼虫的前部，就在下颌的后面，由数量增加的色素颗粒组成。眼点是成人眼睛的眼罩。上面板显示了用解剖显微镜观察的幼虫;下面板是使用相差显微镜在显微镜载玻片上观察幼虫的放大视图，上面有一滴蒸馏水和盖玻片。眼点阶段的命名是根据 Gabrusewycz-Garcia30 的，其中颗粒数计算在最长的行中（例如，12），并记录除最长行之外的额外行数（例如，眼点阶段 6x6）。唾液腺多线染色体中位点特异性 DNA 扩增的开始始于眼点阶段 10x5，并在 14x7 时完成，此时基因座出现转录爆发并扩增 DNA 泡泡31。在随后的边缘眼/下颌阶段，眼点颗粒开始合并，并横向远离中线;幼虫体的长度缩短。此外，DNA 泡泡在这个阶段凝结。在 21 °C 下穿过每个眼点阶段大约需要一天时间。比例尺 = 1 毫米。 请点击此处查看此图的较大版本。

figure-representative results-3619
图 8： B. coprophila 蛹的发育。 在化蛹过程中，除神经系统外，所有幼虫组织都会组织裂解，并被假想盘细胞分裂产生的成体组织所取代。体色从白色变为棕褐色，再变为棕色，再变为黑色。色素逐渐填充蛹眼;减数分裂 I 和 II 发生在雄性蛹中，眼睛 1/4 至 1/2 充满色素36。比例尺 = 1 毫米。 请点击此处查看此图的较大版本。

股票名称标记生育率评论
7298波浪形 （W） 机翼~75%
霍洛2波浪形 （W） 机翼~90%源自 7298
周14波浪形 （W） 翼;白色的眼睛~95%源自 HoLo2
6980波浪形 （W） 翼;肿胀 （SW） 静脉~65%
91 年代弱的波浪形 （W） 翼;娇小 （P） 翅膀~50%Wavy 标记被引入十字架以拯救 91S

表 2：Bradysia （Sciara） coprophila 的种群。Gerbi6 的表 1 列出了这些标记和其他不再存在的标记。X27 着丝粒末端的 5 次易位 （T1、T23、T29、T32、T70） 总结在 Gerbi6 的图 8 中，但已不存在。

补充文件 1：HoLo2（以及 7298 和 W14）杂交、91S 杂交和救援、6980 杂交、易位杂交。请点击此处下载此文件。

Discussion

这里介绍的嗜 粪芽孢杆菌 饲养方案对于希望在实验室中饲养这种生物体进行实验以深入研究其独特生物学特征的科学家非常有用。在梅斯实验室中，使用酵母和蘑菇粉撒在琼脂基上以维持嗜 粪芽孢杆菌29 的饲养方法的初步描述用于饲养 14 种不同种类的 Sciarid 果蝇5。随后，观察到添加荨麻和/或菠菜粉进一步增加了 嗜酸芽孢杆菌 （Gabrusewycz-Garcia，个人交流）的活力。这些方法已经成功地维持了 Sciaridae 家族内的相关物种，包括目前正在培养的 Bradysia impatiens 和 Lycoriella ingenua （Robert Baird，个人通信）。

已经尝试了其他方法（例如下面描述的替代喂养方法）来培养 嗜粪芽孢杆菌，但此处描述的方案已经过优化，以具有最有利的幼虫单位琼脂表面积比例，以获得最肥沃的脂肪成虫并最大限度地减少霉菌的生长。为了扩大规模，可以按照上述方案 2 中的说明在玻璃瓶中进行质量配接。或者，可以将一些 （2-4） 成年雌性与两倍数量的成年雄性一起放入一个培养瓶中，例如用于饲养 果蝇 的培养瓶（一次性 6 盎司 = 177.4 mL 方底 果蝇 聚丙烯瓶）。在这两种情况下，研究人员都必须完全确信培养瓶仅包含所有女性生产者或所有男性生产者母亲。

只喂幼虫，因为蛹和成虫不吃东西。如果幼虫已经变成蛹，请不要喂食小瓶（一个迹象是第一批早出的成蝇出现时）。一旦成虫关闭，如果可用，将小瓶放入较冷的培养箱（例如，16 °C）中，因为这将使成虫活得更久。每周喂食 3 次（例如，周一、周三、周五），随着幼虫年龄的增长，每瓶的喂食量增加。慷慨地喂养，你会得到肥大可育的成年人的回报。但是，如果您喂食过多，会出现白色霉菌，这是减少您存放在小瓶中的食物量的迹象。此外，如果你喂得太多，琼脂顶部会形成一层厚厚的食物垫，使成虫更难出现（你可以用镊子去除垫子，但要注意不要用垫子把幼虫带出来——最好根本不这样做）。幼虫很少（标记为“很少”）的小瓶需要更少的食物。如果你喂得太少，幼虫会爬上小瓶的壁寻找食物。喂养不足的幼虫会导致小成虫的生育能力较差。

替代饲喂方法
已经尝试了多种方法，在幼虫阶段只喂养幼虫一次，而不是每周 3 次。B. coprophila 不会在 果蝇 风格的食物上生长。John Urban（个人通信）尝试将 嗜酸芽孢杆菌 食物与琼脂混合，但滋生了太多霉菌。他发现，混合添加两种霉菌抑制剂（tegosept 和丙酸）并分别尝试几种不同的浓度，在抑制霉菌的水平上，都对 嗜霉芽孢杆菌 有毒。琼脂的 pH 值应为 6-7（中性），因为 嗜酸芽孢杆菌 在酸性 pH 值（如丙酸）下会生病。或者，为了避免每周三次喂食，他尝试使用抹刀或没有针头的注射器，在交配后一周（即，大约幼虫开始出现的时间）将浓稠的酵母糊（Red Star 活性干酵母与少许蒸馏水混合以润湿）作为一团分配到每个小瓶的琼脂顶部。

避免每周喂食三次的另一种方法是在每个小瓶中加入活的真菌培养物。Bath 和 Sponsler37 报道了具有 Sabouraud 培养基的倾斜琼脂表面应用 Chaetoconidia 属（最好）或 Baplosporangia 或 Xllescheria 属的真菌培养物进行条纹。这种真菌是在引入嗜 粪芽孢杆菌 前几天到一周生长的。此后不需要喂食。Ellen Rasch （个人通信） 也采用了这种方法的变体。在我们手中，用这种方法小瓶太湿，幼虫溺水，但可以再次尝试以优化相对于含有活真菌的小瓶的幼虫数量。

Arthur Forer（个人通信）在以与鹤蝇相同的方式饲养 B. coprophila 方面取得了一些成功38.通过这种方法，蛹被饲养在潮湿的 纸浆上。随后，成虫交配，卵沉积在新鲜潮湿的 纸浆上。所得幼虫被保存在培养皿中的 纸浆 上，每周两次用荨麻叶粉喂养。将蛹放入笼子中以重复该循环。

Yukiko Yamashita（个人通信）尝试在土壤上饲养 B. coprophila，但未成功，模仿它们在自然界中高湿度的盆栽植物和温室中的条件。但是，当湿度水平升高时，霉菌会成为一个问题。尽管如此，潮湿的土壤已经成功地用于在装有潮湿土壤的塑料盒中培养假石蒜属（以前的 Bradysia）hygida 幼虫;它们以分解的 Ilex paraguariensis 叶为食，在幼虫晚期补充 1.2% 酵母提取物、1.4% 玉米淀粉、0.8% 燕麦片粉、1.2% 琼脂12。同样，潮湿的土壤可以用带有碎芸豆的潮湿泥炭藓代替，以培养 Sciarid 苍蝇39,40。

还采用了其他方法来维持 Bradysia 的实验室培养：（i） 添加酵母和干血肥的蒸压马铃薯41;（ii） 粪污 42,43,44 可添加干血 45;（iii） 装有化妆棉和装有大豆粉的湿纸巾的塑料容器46.

螨
螨虫可以从果蝇转移到嗜果芽孢杆菌。为了尽量减少这种情况，最好将嗜黑芽孢杆菌放在单独的培养箱或房间里，不要靠近果蝇库存。此外，在处理果蝇之前，请在当天早些时候进行任何嗜果蝇维护工作。螨虫也可以从室内植物转移到嗜红芽孢杆菌，因此不要将植物与嗜红芽孢杆菌放在同一个房间里。如果螨虫侵入小瓶，它们可以被视为在 B. coprophila 身体上爬行的白色小球形生物。用于消灭果蝇中螨虫的化学处理不能用于嗜果蝇，因为化学物质会杀死嗜果蝇（嗜果蝇也对苯酚等有机烟雾敏感）。去除嗜粪芽孢杆菌原液中螨虫的唯一治疗方法是手动将胚胎收集在琼脂平板上，检查每个胚胎是否不含螨虫，然后使用细画笔将它们转移到新鲜的琼脂瓶中。棉布填充的纱布塞和醋酸纤维素泡沫绒毛（用于果蝇聚丙烯样品瓶）都有助于防止螨虫进入样品瓶。

饲养方案的有用性
此处描述的协议将使不断增长的科学家社区能够将 嗜粪芽孢杆菌 饲养为新的/旧的新兴模式生物，以研究其独特的生物学特征。鼓励新的实验室小组加入不断壮大的社区，以维护和研究 Bradysia （Sciara） 的独特生物学特征。

Disclosures

作者没有需要声明的利益冲突。

Acknowledgements

特别感谢以前的嗜 霉 菌畜群饲养员（Jacob E. Bliss、Paula Bonazinga、Anne W. Kerrebrock、Ingrid M. Mercer、Heidi S. Smith）和研究人员（特别是 Robert Baird、Michael S. Foulk、Donna Kubai、John M. Urban、Yutaka Yamamoto）对饲养方案进行了微调。Helen V. Crouse、Natalia Gabrusewycz-Garcia、Reba M. Goodman、Charles W. Metz 和 Ellen Rasch 提供了关于 嗜粪芽孢杆菌 护理的初步说明。感谢 Yukiko Yamashita 和 Anne W. Kerrebrock 接管 Bradysia （Sciara） 库存中心。非常感谢以下人员对图表的帮助准备：Brian Wiegmann（图 1）、John M. Urban（图 4 上面板）、Laura Ross（图 4 下面板）、Yutaka Yamamoto（图 5 左面板）、Leo Kadota（图 7 和 图 8）。非常感谢 Ava Filiss 和布朗大学多学科实验室在摄影和拍摄方面的帮助。感谢 Robert Baird 对手稿的评论。我们对 嗜粪芽孢杆菌 的研究和维护得到了 NIH 和 NSF 的支持，包括 NIH GM121455 对 S.A.G 的最新支持。有关 嗜粪芽孢杆菌 的更多详细信息，请访问目前正在建设的 Bradysia （Sciara） 种群中心网站（https://sites.brown.edu/sciara/ 和 https://sciara.wi.mit.edu）。

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar (bacteriological)U.S. BiologicalA0930https://www.usbio.net; 
CO2 FlyStuff Foot PedalGenesee Scientific59-121
CO2 FlyStuff BlowgunGenesee Scientific54-104
CO2 FlyStuff UltimaterFlypadGenesee Scientific59-172https://www.geneseesci.com
Ether fume hoodLabconco 3955220Sits on top of lab bench
         Filter replacement  cat # 6961300
Food: Brewer’s Yeast PowderSolgar   Obtain from Amazon or health food store
         https://www.solgar.com;
Food: Nettle Powder  (pesticide free)Starwest Botanicals209460-51
Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)Starwest Botanicals202127-5https://www.starwest-botanicals.com;
Food: Spinach Powder ( pesticide free)Starwest Botanicals209583-5
Food: Straw (pesticide free )Starwest Botanicals209465-3
Jar: clear glass, polypropylene lidFisher Scientific:FB0291176573 mm dia, 89 mm ht (240 ml)
https://www.fishersci.com;
Needle Probe, wooden handleUS Geo Supply IncSKU: 41905.75” long probe,
stainless steel needle
https://usgeosupply.com; (970)-434-3708
Vials: glass, preferred:Wilmad LabGlass
Wilmad-glass custom vials28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht
Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com
Vials: glass (cheaper and ok) Fisher Scientific03-339-26H29 mm outer dia, 9.5 cm h
 https://www.fishersci.com; 
Vials: glass (a bit narrow) Genesee Scientific 32-20124.5 mm outer dia,9.5 cm h
thttps://www.geneseesci.com
Vials: polypropylene Genesee Scientific32-11428.5 mm outer dia,9.5 cm ht
Vial Plugs
roll of non-absorbent cottonFisher Scientific22-456881
cheeseclothFisher Scientific22-055053https://www.fishersci.com;

References

  1. Lewin, H. A., et al. Earth BioGenome project: Sequencing life for the future of life. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (17), 4325-4333 (2018).
  2. Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (14), 5690-5695 (2011).
  3. Yeates, D. K., Wiegmann, B. M. Phylogeny of Diptera. Manual of Afrotropical Diptera.Suricata. 3, 149-161 (2017).
  4. Vilkamaa, P., Burdíková, N., Ševčík, J. The genus Spinopygina gen. nov. (Diptera, Sciaridae) from Western North America: Preliminary molecular phylogeny and description of seven new species. Insects. 14 (2), 173 (2023).
  5. Metz, C. W. Chromosome behavior, inheritance and sex determination in Sciara. Amer Naturalist. 72 (743), 485-520 (1938).
  6. Gerbi, S. A., Hennig, N. Unusual chromosome movements in Sciarid flies. Results and Problems in Cell Differentiation. Vol 13 Germ Line - Soma Differentiation. 13, 71-104 (1986).
  7. Gerbi, S. A., Larracuente, A., Hanlon, S. Non-random chromosome segregation and chromosome eliminations in the fly Bradysia (Sciara). 34;Non-Mendelian Inheritance and Meiotic Drive.", Chromosome Research.(special issue). 30, 273-288 (2022).
  8. Steffan, W. A. A generic revision of the family Sciaridae (Diptera) of America North of Mexico. University of California Publications in Entomology. 44, 1-77 (1966).
  9. Shin, S., Jung, S., Menzel, F., Heller, K., Lee, H. Molecular phylogeny of black fungus gnats (Diptera: Sciaroidea: Sciaridae) and the evolution of larval habitats. Molec Phylogenetics Evolution. 66 (3), 833-846 (2013).
  10. Mohrig, W., Heller, K., Hippa, H., Vilkamaa, P., Menzel, F. Revision of the black fungus gnats (Diptera: Sciaridae) of North America. Studia Dipterologica. 19 (1-2), 141-286 (2013).
  11. Ševčík, J., et al. Molecular phylogeny of the megadiverse insect infraorder Bibionomorpha sensu lato (Diptera). PeerJ. 4, e2563 (2016).
  12. Menzel, F., et al. Pseudolycoriella hygida (Sauaia and Alves)-An overview of a model organism in genetics, with new aspects in morphology and systematics. Insects. 15 (2), 118 (2024).
  13. Meigen, J. W. . Klassifikazion und Beschreibung der europäischen zweiflügligen Insekten (Diptera Linn). 1 (1), (1804).
  14. Johannsen, O. A. The fungus gnats of North America part I. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 172, 209-276 (1909).
  15. Johannsen, O. A. Mycetophilidae of North America. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 200, 57-146 (1912).
  16. Urban, J. M., et al. Bradysia (Sciara) coprophila larvae up-regulate DNA repair pathways and down-regulate developmental regulators in response to ionizing radiation. Genetics. (3), (2024).
  17. Hodson, C. N., Jaron, K. S., Gerbi, S., Ross, L. Gene-rich germline-restricted chromosomes in black-winged fungus gnats evolved through hybridization. PLoS Biology. 20 (2), e3001559 (2021).
  18. Urban, J. M., et al. High contiguity de novo genome assembly and DNA modification analyses for the fungus fly, Sciara coprophila, using single-molecule sequencing. BMC Genomics. 22, 643 (2021).
  19. Baird, R. B., et al. Recent evolution of a maternally acting sex-determining supergene in a fly with single-sex broods. Mol Biol Evol. 40 (7), (2023).
  20. Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Making ends meet: targeted integration of DNA fragments by genome editing. Chromosoma. 127 (4), 405-420 (2018).
  21. Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Development of transformation for genome editing of an emerging model organism. Genes. 13 (7), 1108-1124 (2022).
  22. Metz, C. W., Smith, H. B. Further observation on the nature of the x-prime (X') chromosome in Sciara. Proc Nat Acad Sci USA. 17 (4), 195-198 (1931).
  23. Crouse, H. V. X-ray induced sex-linked recessive lethals and visibles in Sciara coprophila. Amer Naturalist. 95 (880), 21-26 (1961).
  24. Metz, C. W., Ullian, S. S. Genetic identification of the sex chromosomes in Sciara (Diptera). Proc Nat Acad Sci USA. 15 (2), 82-85 (1929).
  25. Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). I. Centromere localization. Chromosoma. 63, 39-55 (1977).
  26. Crouse, H. V., Gerbi, S. A., Liang, C. M., Magnus, L., Mercer, I. M. Localization of ribosomal DNA within the proximal X heterochromatin of Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). Chromosoma. 64 (4), 305-318 (1977).
  27. Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). II. The controlling element. Chromosoma. 74, 219-239 (1979).
  28. Mok, E. H., et al. Maintenance of the DNA puff expanded state is independent of active replication and transcription. Chromosoma. 110 (3), 186-196 (2001).
  29. Smith-Stocking, H. Genetic studies on selective segregation of chromosomes in Sciara coprophila Lintner. Genetics. 21 (4), 421-443 (1936).
  30. Gabrusewycz-Garcia, N. Cytological and autoradiographic studies in Sciara coprophila salivary gland chromosomes. Chromosoma. 15, 312-344 (1964).
  31. Wu, N., Liang, C., DiBartolomeis, S. M., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Developmental progression of DNA puffs in Sciara coprophila: amplification and transcription. Dev Biol. 160 (1), 73-84 (1993).
  32. Yamamoto, Y., Gustafson, E. A., Foulk, M. S., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Anatomy and evolution of a DNA replication origin. Chromosoma. 130 (2-3), 199-214 (2021).
  33. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
  34. Bertone, M. A., Courtney, G. W., Wiegmann, B. M. Phylogenetics and temporal diversification of the earliest true flies (Insecta: Diptera) based on multiple nuclear genes. Syst Entomol. 33, 668-687 (2008).
  35. de Saint Phalle, B., Sullivan, W. Incomplete sister chromatid separation is the mechanism of programmed chromosome elimination during early Sciara coprophila embryogenesis. Development. 122 (12), 3775-3784 (1996).
  36. de Saint Phalle, B., Oldenbourg, R., Kubai, D., Salmon, E. D., Gerbi, S. A. Paternal chromosome elimination and X non-disjunction on asymmetric spindles in Sciara male meiosis. BioRxiv. , (2021).
  37. Bath, J. D., Sponsler, O. L. An alternative method for the culture of Sciara larvae. Science. 109 (2828), 255 (1949).
  38. Forer, A. Crane fly spermatocytes and spermatids: A system for studying cytoskeletal components. Methods Cell Biol. 25, 227-252 (1982).
  39. Gillespie, D. R. A simple rearing method for fungus gnats Corynoptera sp. (Diptera: Sciaridae) with notes on life history. J Entomol Soc Br Colum. 83, 45-48 (1986).
  40. Gardiner, R. B., Jarvis, W. R., Shipp, J. L. Ingestion of Pythium spp. by larvae of the fungus gnat Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae). Ann Appl Biol. 116, 205-212 (1990).
  41. Hungerford, H. B. Sciara maggots injurious to potted plants. J Econ Entomol. 9 (6), 538-549 (1916).
  42. Thomas, C. A. A method for rearing mushroom insects and mites. Entomol News. 40, 222-225 (1929).
  43. Austin, M. D., Pitcher, R. S. A laboratory method for rearing Sciara and phorid flies. Entomol Mon Mag. 72, 12-15 (1936).
  44. Butt, F. H., Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. Culture of Sciara. Culture methods for invertebrate animals. , 400-401 (1937).
  45. Hudson, E. K. Regulation of greenhouse sciarid fly populations using Tetradonema plicans (Nematoda: Mermithoidea). J Invert Pathol. 23 (1), 85-91 (1974).
  46. Wilkinson, J. D., Daughterty, D. M. Comparative development of Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae) under constant and variable temperatures. Ann Entomol Soc Am. 63 (4), 1079-1083 (1970).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bradysia Sciara Coprophila DNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved