一种在小鼠胚胎心脏中进行基因递送的高效转基因方法

Summary

该协议为发育中的小鼠心脏中基于电穿孔的心肌细胞转基因提供了详细的方法框架。此处提供的视频资源将有助于学习这种通用技术。

Abstract

哺乳动物心脏是一个复杂的器官，在发育过程中 通过 高度多样化的祖细胞群形成。这些祖先的起源、招募时间和命运对于该器官的正常发育至关重要。控制心脏形态发生的分子机制对于理解先天性心脏病和胚胎心脏再生的发病机制至关重要。研究这些机制的经典方法采用转基因小鼠的产生来评估心脏发育过程中特定基因的功能。然而，小鼠转基因是一个复杂、耗时的过程，通常无法评估特定基因在心脏发育过程中的作用。为了解决这个问题，我们开发了一种小鼠胚胎心脏高效电穿孔和培养的方案，使瞬时转基因能够快速评估参与心脏发育的基因功能获得或丧失的影响。使用这种方法，我们成功地在胚胎心脏中过表达 Meis1，并优先进行心外膜细胞转染，证明了该技术的能力。

Introduction

心脏是胚胎发育过程中形成的第一个器官。这个过程涉及来自胚胎不同区域的各种祖细胞群的时空协调。所有这一切都是在发育中的心脏继续跳动和功能的同时发生的，强调了其形成所需的非凡协调性 ^1,2,3。鉴于心脏的关键作用，细胞和分子水平的严格调节对于心脏的正常形成至关重要 ^4,5。确定控制心脏发育的机制一直非常有趣，因为它们对于解开先天性心脏病至关重要，先天性心脏病影响着全世界的大量患者⁶。此外，理解心脏发育对于破译心脏再生至关重要，因为出生后哺乳动物的心脏保留了在成年后丢失或受阻的再生能力 ^7,8。因此，剖析心脏发育的分子调节因子对于推进先天性心脏病和心脏再生的研究工作至关重要。

为了实现这一目标，人们越来越关注研究心外膜在心脏发育和再生中的作用⁹。心外膜是一层薄薄的间皮组织，构成哺乳动物心脏的最外层（图 1）。最近....

Protocol

所有动物程序均已获得 CNIC 动物实验伦理委员会的批准，并符合现行法规，包括欧盟指令 2010/63EU 和建议 2007/526/EC，由西班牙法律根据 Real Decreto 53/2013 执行。对于该方案，使用了 15-21 周龄的雌性野生型 CD-1 小鼠。有关所用动物、试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表。

1. 质粒和工具制备

1. 首先，通过在冰中加入终浓度为 1 μg/μL 的所需质粒 DNA.......

Discussion

总体而言，此处描述的方法为在发育中的心外膜中表达转基因构建体提供了一个强大的框架（图 4B），如 Meis1 过表达所示（图 4C）。通过适当的构建体，该方案可用于瞬时评估特定基因的功能获得 （GOF） 或功能丧失 （LOF） 的影响。LOF可以通过 RNA 干扰转染靶向候选基因的质粒来实施^{到该技术中 26}。基因 GOF 或 LOF 的快速评估特别有?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Forceps	Dumont	11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate	BD Falcon	353043
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
40 µm Cell Strainer	Fischer Scientific	08-771-1
50 mL tubes	BD Falcon	352070
70 µm Cell Strainer	Corning	CLS431751
Anti-GFP Policlonal Antibody	Invitrogen	A10262	1:1000 dilution used
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody	Invitrogen	14-6503-82	1:500 dilution used
CD1 Wild Type mice			Provided by Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signalling Technologies	9661	1:400 dilution used
DAPI	Cell Signalling Technologies	4083	1:1000 dilution used
Dispase/collagenase	Roche	10269638001
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10313021
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0	Leica	11524102
Liberase	Roche	5401119001
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	SU-P-97
pCAG expression plasmid	Addgene	#89689
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri dishes 35 × 10 mm	BD Falcon	351008
Petri dishes 60 × 15 mm	BD Falcon	353002
Phenol Red	Merck	P3532
Pipette tips			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody	Abcam	ab89901	1:300 dilution used
Square Wave Electroporator CUY21SC	Nepa Gene	CUY664-10X15
Sterile PBS			Provided and autoclaved by technical unit
Sucrose	Millipore	84100
Tweezer electrodes with variable gap	Nepa Gene	CUY650P5