A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מציג מסגרת מתודולוגית מפורטת לטרנסגנזה מבוססת אלקטרופורציה של תאי לב בהתפתחות לבבות עכברים. נכסי הווידאו המסופקים כאן יקלו על למידה של טכניקה רב-תכליתית זו.
לב היונקים הוא איבר מורכב שנוצר במהלך ההתפתחות באמצעות אוכלוסיות מגוונות מאוד של תאי אב. מקורם, עיתוי גיוסם וגורלם של אבות אלה חיוניים להתפתחותו התקינה של איבר זה. המנגנונים המולקולריים השולטים במורפוגנזה של הלב חיוניים להבנת הפתוגנזה של מחלות לב מולדות והתחדשות לב עוברית. גישות קלאסיות לחקר מנגנונים אלה השתמשו ביצירת עכברים טרנסגניים כדי להעריך את תפקודם של גנים ספציפיים במהלך התפתחות הלב. עם זאת, טרנסגנזה של עכברים היא תהליך מורכב, גוזל זמן שלעתים קרובות לא ניתן לבצע כדי להעריך את תפקידם של גנים ספציפיים במהלך התפתחות הלב. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו פרוטוקול לאלקטרופורציה יעילה ולתרבית של לבבות עובריים של עכברים, המאפשר טרנסגנזה חולפת להעריך במהירות את ההשפעה של רווח או אובדן תפקוד של גנים המעורבים בהתפתחות הלב. באמצעות מתודולוגיה זו, ביטאנו בהצלחה את Meis1 בלב העוברי, עם העדפה להתמרה של תאים אפיקרדיאליים, תוך הדגמת יכולות הטכניקה.
הלב הוא האיבר הראשון שנוצר במהלך ההתפתחות העוברית. תהליך זה כרוך בתיאום מרחבי-זמני של אוכלוסיות שונות של תאי אב מאזורים שונים של העובר. כל זה קורה בזמן שהלב המתפתח ממשיך לפעום ולתפקד, תוך הדגשת הקואורדינציה יוצאת הדופן הנדרשת להיווצרותו 1,2,3. בהתחשב בתפקיד המכריע של הלב, ויסות הדוק ברמה התאית והמולקולרית חיוני להיווצרותו התקינה 4,5. זיהוי המנגנונים השולטים בהתפתחות הלב מעורר עניין רב, שכן הם חיוניים לפענוח הפרעות לב מולדות, המשפיעות על מספר ניכר של חולים ברחבי העולם6. יתר על כן, הבנת התפתחות ה....
כל הנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים של CNIC ותאמו את החקיקה הנוכחית, כולל הנחיית האיחוד האירופי 2010/63EU והמלצה 2007/526/EC, כפי שנאכפה על ידי החוק הספרדי תחת צו אמיתי 53/2013. עבור פרוטוקול זה, נקבות עכברי בר מסוג CD-1 בגילאי 15-21 שבועות הועסקו. פרטים על בעלי החיים, ריאגנטים ו?.......
כדי להדגים את יעילותה של טכניקה זו בביצוע ניסויי רווח של תפקוד (GOF) עבור רגולטורים התפתחותיים רלוונטיים של הלב, התחשמל מבנה המבטא יתר על המידה את גורם השעתוק Meis1. כדי להשיג זאת, RNA הופק מעוברים E9.5, ושעתוק לאחור בוצע כדי לקבל DNA משלים (cDNA). באמצעות שימוש ב-cDNA כתבנית, רצף הקידוד Meis1 שוכפל (טבלה .......
באופן כללי, המתודולוגיה המתוארת כאן מציעה מסגרת איתנה לביטוי מבנים טרנסגניים באפיקרדיום המתפתח (איור 4B), כפי שמודגם על-ידי ביטוי יתר של Meis1 (איור 4C). עם המבנים המתאימים, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך באופן זמני את ההשפעה של רווח של תפקוד (GOF) או אובדן תפקוד (L.......
מחקר זה נתמך על ידי מענק RTI2018-097617-J-I00 מ- Ministerio de Ciencia e Innovación הספרדי ו- Acción 9 מאוניברסיטת חאאן ל- O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 מה- Ministerio de Ciencia e Innovación הספרדי ומענק H2020-MSCA-ITN-2016-722427 מתוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי ל- M.T. JMG נתמך על ידי מלגת דוקטורט ממשרד המדע הספרדי וקרן Severo Ochoa (PRE2022-101884). הן CNIC והן CBMSO נתמכים על ידי משרד המדע הספרדי, וה- CNIC נתמך על ידי קרן ProCNIC.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
#55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate | BD Falcon | 353043 | |
35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
40 µm Cell Strainer | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
70 µm Cell Strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-GFP Policlonal Antibody | Invitrogen | A10262 | 1:1000 dilution used |
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody | Invitrogen | 14-6503-82 | 1:500 dilution used |
CD1 Wild Type mice | Provided by Animalary Unit (CNIC) | ||
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signalling Technologies | 9661 | 1:400 dilution used |
DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | 1:1000 dilution used |
Dispase/collagenase | Roche | 10269638001 | |
Distilled water | |||
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51032720 | |
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0 | Leica | 11524102 | |
Liberase | Roche | 5401119001 | |
Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
pCAG expression plasmid | Addgene | #89689 | |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Petri dishes 35 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
Petri dishes 60 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
Phenol Red | Merck | P3532 | |
Pipette tips | Reused from old laboratory equipment | ||
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody | Abcam | ab89901 | 1:300 dilution used |
Square Wave Electroporator CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
Sterile PBS | Provided and autoclaved by technical unit | ||
Sucrose | Millipore | 84100 | |
Tweezer electrodes with variable gap | Nepa Gene | CUY650P5 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved