Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג מסגרת מתודולוגית מפורטת לטרנסגנזה מבוססת אלקטרופורציה של תאי לב בהתפתחות לבבות עכברים. נכסי הווידאו המסופקים כאן יקלו על למידה של טכניקה רב-תכליתית זו.

Abstract

לב היונקים הוא איבר מורכב שנוצר במהלך ההתפתחות באמצעות אוכלוסיות מגוונות מאוד של תאי אב. מקורם, עיתוי גיוסם וגורלם של אבות אלה חיוניים להתפתחותו התקינה של איבר זה. המנגנונים המולקולריים השולטים במורפוגנזה של הלב חיוניים להבנת הפתוגנזה של מחלות לב מולדות והתחדשות לב עוברית. גישות קלאסיות לחקר מנגנונים אלה השתמשו ביצירת עכברים טרנסגניים כדי להעריך את תפקודם של גנים ספציפיים במהלך התפתחות הלב. עם זאת, טרנסגנזה של עכברים היא תהליך מורכב, גוזל זמן שלעתים קרובות לא ניתן לבצע כדי להעריך את תפקידם של גנים ספציפיים במהלך התפתחות הלב. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו פרוטוקול לאלקטרופורציה יעילה ולתרבית של לבבות עובריים של עכברים, המאפשר טרנסגנזה חולפת להעריך במהירות את ההשפעה של רווח או אובדן תפקוד של גנים המעורבים בהתפתחות הלב. באמצעות מתודולוגיה זו, ביטאנו בהצלחה את Meis1 בלב העוברי, עם העדפה להתמרה של תאים אפיקרדיאליים, תוך הדגמת יכולות הטכניקה.

Introduction

הלב הוא האיבר הראשון שנוצר במהלך ההתפתחות העוברית. תהליך זה כרוך בתיאום מרחבי-זמני של אוכלוסיות שונות של תאי אב מאזורים שונים של העובר. כל זה קורה בזמן שהלב המתפתח ממשיך לפעום ולתפקד, תוך הדגשת הקואורדינציה יוצאת הדופן הנדרשת להיווצרותו 1,2,3. בהתחשב בתפקיד המכריע של הלב, ויסות הדוק ברמה התאית והמולקולרית חיוני להיווצרותו התקינה 4,5. זיהוי המנגנונים השולטים בהתפתחות הלב מעורר עניין רב, שכן הם חיוניים לפענוח הפרעות לב מולדות, המשפיעות על מספר ניכר של חולים ברחבי העולם6. יתר על כן, הבנת התפתחות ה....

Protocol

כל הנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים של CNIC ותאמו את החקיקה הנוכחית, כולל הנחיית האיחוד האירופי 2010/63EU והמלצה 2007/526/EC, כפי שנאכפה על ידי החוק הספרדי תחת צו אמיתי 53/2013. עבור פרוטוקול זה, נקבות עכברי בר מסוג CD-1 בגילאי 15-21 שבועות הועסקו. פרטים על בעלי החיים, ריאגנטים ו?.......

Representative Results

כדי להדגים את יעילותה של טכניקה זו בביצוע ניסויי רווח של תפקוד (GOF) עבור רגולטורים התפתחותיים רלוונטיים של הלב, התחשמל מבנה המבטא יתר על המידה את גורם השעתוק Meis1. כדי להשיג זאת, RNA הופק מעוברים E9.5, ושעתוק לאחור בוצע כדי לקבל DNA משלים (cDNA). באמצעות שימוש ב-cDNA כתבנית, רצף הקידוד Meis1 שוכפל (טבלה .......

Discussion

באופן כללי, המתודולוגיה המתוארת כאן מציעה מסגרת איתנה לביטוי מבנים טרנסגניים באפיקרדיום המתפתח (איור 4B), כפי שמודגם על-ידי ביטוי יתר של Meis1 (איור 4C). עם המבנים המתאימים, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך באופן זמני את ההשפעה של רווח של תפקוד (GOF) או אובדן תפקוד (L.......

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענק RTI2018-097617-J-I00 מ- Ministerio de Ciencia e Innovación הספרדי ו- Acción 9 מאוניברסיטת חאאן ל- O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 מה- Ministerio de Ciencia e Innovación הספרדי ומענק H2020-MSCA-ITN-2016-722427 מתוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי ל- M.T. JMG נתמך על ידי מלגת דוקטורט ממשרד המדע הספרדי וקרן Severo Ochoa (PRE2022-101884). הן CNIC והן CBMSO נתמכים על ידי משרד המדע הספרדי, וה- CNIC נתמך על ידי קרן ProCNIC.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#55 ForcepsDumont 11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture PlateBD Falcon353043
35 mm vise table GrandadoSKU 8798771617573
40 µm Cell StrainerFischer Scientific08-771-1
50 mL tubesBD Falcon352070
70 µm Cell StrainerCorningCLS431751
Anti-GFP Policlonal AntibodyInvitrogenA102621:1000 dilution used
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal AntibodyInvitrogen14-6503-821:500 dilution used
CD1 Wild Type miceProvided by Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) AntibodyCell Signalling Technologies96611:400 dilution used
DAPICell Signalling Technologies40831:1000 dilution used
Dispase/collagenaseRoche10269638001
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco10313021
Fetal Bovine SerumInvitrogen10438-026
Heracell 150i CO2 IncubatorThermo Scientific51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0Leica11524102
LiberaseRoche5401119001
Micropipette Puller Model P-97Sutter InstrumentSU-P-97
pCAG expression plasmidAddgene#89689
Penicillin-streptomycinInvitrogen15070-063
Petri dishes 35 × 10 mmBD Falcon351008
Petri dishes 60 × 15 mmBD Falcon353002
Phenol RedMerckP3532
Pipette tipsReused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SDJanvier Labs9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) AntibodyAbcamab899011:300 dilution used
Square Wave Electroporator CUY21SCNepa GeneCUY664-10X15
Sterile PBSProvided and autoclaved by technical unit
Sucrose Millipore84100
Tweezer electrodes with variable gapNepa GeneCUY650P5

References

Explore More Articles

Meis1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved