Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo

Summary

Questo protocollo presenta un quadro metodologico dettagliato per la transgenesi basata sull'elettroporazione di cellule cardiache in cuori di topo in via di sviluppo. Le risorse video fornite qui faciliteranno l'apprendimento di questa tecnica versatile.

Abstract

Il cuore dei mammiferi è un organo complesso formatosi durante lo sviluppo attraverso popolazioni molto diverse di cellule progenitrici. L'origine, i tempi di reclutamento e il destino di questi progenitori sono vitali per il corretto sviluppo di questo organo. I meccanismi molecolari che governano la morfogenesi del cuore sono essenziali per comprendere la patogenesi delle cardiopatie congenite e della rigenerazione cardiaca embrionale. Gli approcci classici per studiare questi meccanismi hanno impiegato la generazione di topi transgenici per valutare la funzione di geni specifici durante lo sviluppo cardiaco. Tuttavia, la transgenesi del topo è un processo complesso e dispendioso in termini di tempo che spesso non può essere eseguito per valutare il ruolo di geni specifici durante lo sviluppo del cuore. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo per l'elettroporazione e la coltura efficienti di cuori embrionali di topo, consentendo alla transgenesi transitoria di valutare rapidamente l'effetto del guadagno o della perdita di funzione dei geni coinvolti nello sviluppo cardiaco. Utilizzando questa metodologia, abbiamo sovraespresso con successo Meis1 nel cuore embrionale, con una preferenza per la trasfezione di cellule epicardiche, dimostrando le capacità della tecnica.

Introduction

Il cuore è il primo organo che si forma durante lo sviluppo embrionale. Questo processo comporta la coordinazione spazio-temporale di varie popolazioni di cellule progenitrici provenienti da aree distinte dell'embrione. Tutto ciò avviene mentre il cuore in via di sviluppo continua a battere e a funzionare, sottolineando la notevole coordinazione necessaria per la sua formazione ^1,2,3. Dato il ruolo cruciale del cuore, una stretta regolazione a livello cellulare e molecolare è essenziale per la sua corretta formazione ^4,5

Protocol

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del CNIC e sono conformi alla legislazione vigente, tra cui la Direttiva UE 2010/63 e la Raccomandazione 2007/526/CE, come applicato dalla legge spagnola ai sensi del Real Decreto 53/2013. Per questo protocollo, sono stati impiegati topi CD-1 femmina wild-type di età compresa tra 15 e 21 settimane. I dettagli relativi agli animali, ai reagenti e alle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei ma.......

Discussion

Nel complesso, la metodologia qui descritta offre un quadro robusto per l'espressione di costrutti transgenici nell'epicardio in via di sviluppo (Figura 4B), come dimostrato dalla sovraespressione di Meis1 (Figura 4C). Con i costrutti appropriati, questo protocollo può essere utilizzato per valutare transitoriamente l'impatto del guadagno di funzione (GOF) o della perdita di funzione (LOF) di un gene specifico. La LOF può essere implementata nella tecnica tras.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Forceps	Dumont	11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate	BD Falcon	353043
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
40 µm Cell Strainer	Fischer Scientific	08-771-1
50 mL tubes	BD Falcon	352070
70 µm Cell Strainer	Corning	CLS431751
Anti-GFP Policlonal Antibody	Invitrogen	A10262	1:1000 dilution used
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody	Invitrogen	14-6503-82	1:500 dilution used
CD1 Wild Type mice			Provided by Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signalling Technologies	9661	1:400 dilution used
DAPI	Cell Signalling Technologies	4083	1:1000 dilution used
Dispase/collagenase	Roche	10269638001
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10313021
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0	Leica	11524102
Liberase	Roche	5401119001
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	SU-P-97
pCAG expression plasmid	Addgene	#89689
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri dishes 35 × 10 mm	BD Falcon	351008
Petri dishes 60 × 15 mm	BD Falcon	353002
Phenol Red	Merck	P3532
Pipette tips			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody	Abcam	ab89901	1:300 dilution used
Square Wave Electroporator CUY21SC	Nepa Gene	CUY664-10X15
Sterile PBS			Provided and autoclaved by technical unit
Sucrose	Millipore	84100
Tweezer electrodes with variable gap	Nepa Gene	CUY650P5