Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos

Summary

Este protocolo apresenta uma estrutura metodológica detalhada para a transgênese baseada em eletroporação de células cardíacas em corações de camundongos em desenvolvimento. Os recursos de vídeo fornecidos aqui facilitarão o aprendizado dessa técnica versátil.

Abstract

O coração de mamíferos é um órgão complexo formado durante o desenvolvimento por meio de populações altamente diversas de células progenitoras. A origem, o momento do recrutamento e o destino desses progenitores são vitais para o desenvolvimento adequado desse órgão. Os mecanismos moleculares que governam a morfogênese do coração são essenciais para a compreensão da patogênese das cardiopatias congênitas e da regeneração cardíaca embrionária. Abordagens clássicas para investigar esses mecanismos empregaram a geração de camundongos transgênicos para avaliar a função de genes específicos durante o desenvolvimento cardíaco. No entanto, a transgênese de camundongos é um processo complexo e demorado que muitas vezes não pode ser realizado para avaliar o papel de genes específicos durante o desenvolvimento do coração. Para resolver isso, desenvolvemos um protocolo para eletroporação e cultura eficientes de corações embrionários de camundongos, permitindo que a transgênese transitória avalie rapidamente o efeito do ganho ou perda de função de genes envolvidos no desenvolvimento cardíaco. Usando essa metodologia, superexpressamos com sucesso Meis1 no coração embrionário, com preferência pela transfecção de células epicárdicas, demonstrando as capacidades da técnica.

Introduction

O coração é o primeiro órgão formado durante o desenvolvimento embrionário. Este processo envolve a coordenação espaço-temporal de várias populações de células progenitoras de áreas distintas do embrião. Tudo isso ocorre enquanto o coração em desenvolvimento continua batendo e funcionando, enfatizando a notável coordenação necessária para sua formação ^1,2,3. Dado o papel crucial do coração, a regulação rigorosa nos níveis celular e molecular é essencial para sua formação adequada ^4,5. Identificar os mecanismos que con....

Protocol

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da CNIC e em conformidade com a legislação vigente, incluindo a Diretiva da UE 2010/63UE e a Recomendação 2007/526/CE, conforme aplicado pela Lei Espanhola sob o Real Decreto 53/2013. Para este protocolo, foram empregadas fêmeas de camundongos CD-1 do tipo selvagem com idade entre 15 e 21 semanas. Detalhes sobre os animais, reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

Discussion

No geral, a metodologia descrita aqui oferece uma estrutura robusta para expressar construções transgênicas no epicárdio em desenvolvimento (Figura 4B), conforme demonstrado pela superexpressão de Meis1 (Figura 4C). Com as construções apropriadas, este protocolo pode ser usado para avaliar transitoriamente o impacto do ganho de função (GOF) ou perda de função (LOF) de um gene específico. O LOF pode ser implementado na técnica transfectando um plasm?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Forceps	Dumont	11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate	BD Falcon	353043
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
40 µm Cell Strainer	Fischer Scientific	08-771-1
50 mL tubes	BD Falcon	352070
70 µm Cell Strainer	Corning	CLS431751
Anti-GFP Policlonal Antibody	Invitrogen	A10262	1:1000 dilution used
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody	Invitrogen	14-6503-82	1:500 dilution used
CD1 Wild Type mice			Provided by Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signalling Technologies	9661	1:400 dilution used
DAPI	Cell Signalling Technologies	4083	1:1000 dilution used
Dispase/collagenase	Roche	10269638001
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10313021
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0	Leica	11524102
Liberase	Roche	5401119001
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	SU-P-97
pCAG expression plasmid	Addgene	#89689
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri dishes 35 × 10 mm	BD Falcon	351008
Petri dishes 60 × 15 mm	BD Falcon	353002
Phenol Red	Merck	P3532
Pipette tips			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody	Abcam	ab89901	1:300 dilution used
Square Wave Electroporator CUY21SC	Nepa Gene	CUY664-10X15
Sterile PBS			Provided and autoclaved by technical unit
Sucrose	Millipore	84100
Tweezer electrodes with variable gap	Nepa Gene	CUY650P5