يود المؤلفون أن يشكروا المرضى على موافقتهم المستنيرة ومشاركتهم في الدراسة البحثية ، والموظفين السريريين على مساعدتهم الممتازة. تم إنشاء الشكل 1A باستخدام BioRender.com. تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة العلوم في أيرلندا - وهي جائزة التطوير الوظيفي (CDA) إلى K.N. (SFI-13 / CDA / 2171) ، ومنحة مركز الأبحاث (SFI-12 / RC / 2273) ، وجائزة مركز الأبحاث (SFI-14 / SP / 2710) إلى APC Microbiome Ireland. وتلقى ب. ف. أيضا تمويلا من SFI/20/RP/9007.

القياس الكمي لموت الخلايا في القولون البشري استجابة للاضطرابات السامة للخلايا

<ol>
	<li>Patankar, J. V., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+the+gut+epithelium+and+implications+for+chronic+inflammation.">Cell death in the gut epithelium and implications for chronic inflammation.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (9), 543-556 (2020).</li><li>Zeissig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+epithelial+apoptosis+and+barrier+repair+in+active+Crohn's+disease+by+tumour+necrosis+factor+alpha+antibody+treatment.">Downregulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn's disease by tumour necrosis factor alpha antibody treatment.</a> Gut. 53 (9), 1295-1302 (2004).</li><li>Bartee, E., Mcfadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+synergy:+An+underappreciated+contributor+to+innate+anti-viral+immunity.">Cytokine synergy: An underappreciated contributor to innate anti-viral immunity.</a> Cytokine. 63 (3), 237-240 (2013).</li><li>Fish, S. M., Proujansky, R., Reenstra, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effects+of+interferon+&#947;+and+tumour+necrosis+factor+&#945;+on+T84+cell+function.">Synergistic effects of interferon &#947; and tumour necrosis factor &#945; on T84 cell function.</a> Gut. 45 (2), 191-198 (1999).</li><li>Wakisaka, Y., Sugimoto, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+medicine+for+Inflammatory+Bowel+Disease.">Organoid medicine for Inflammatory Bowel Disease.</a> Stem Cells. 40 (2), 123-132 (2022).</li><li>Flood, P., Hanrahan, N., Nally, K., Melgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids:+Modeling+gastrointestinal+physiology+and+immunopathology+-+current+applications+and+limitations.">Human intestinal organoids: Modeling gastrointestinal physiology and immunopathology - current applications and limitations.</a> Eur J Immunol. 54 (2), e2250248 (2024).</li><li>Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intestinal+organoid-based+platform+that+recreates+susceptibility+to+t-cell-mediated+tissue+injury.">An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to t-cell-mediated tissue injury.</a> Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).</li><li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+responses+to+IL-17+in+adult+stem+cell-derived+human+intestinal+organoids.">Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids.</a> J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).</li><li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-&#945;+synergises+with+IFN-&#947;+to+induce+caspase-8-JAK1/2-STAT1-dependent+death+of+intestinal+epithelial+cells.">TNF-&#945; synergises with IFN-&#947; to induce caspase-8-JAK1/2-STAT1-dependent death of intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 12 (10), 864 (2021).</li><li>Flood, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sensor-associated+type+I+interferon+signaling+is+increased+in+ulcerative+colitis+and+induces+jak-dependent+inflammatory+cell+death+in+colonic+organoids.">DNA sensor-associated type I interferon signaling is increased in ulcerative colitis and induces jak-dependent inflammatory cell death in colonic organoids.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G439-G460 (2022).</li><li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy.">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5 (5), e1228 (2014).</li><li>Bode, K. J., Mueller, S., Schweinlin, M., Metzger, M., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+simple+fluorometric+method+to+detect+cell+death+in+3D+intestinal+organoids.">A fast and simple fluorometric method to detect cell death in 3D intestinal organoids.</a> Biotechniques. 67 (1), 23-28 (2019).</li><li>Mertens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-repurposing+screen+on+patient-derived+organoids+identifies+therapy-induced+vulnerability+in+KRAS-mutant+colon+cancer.">Drug-repurposing screen on patient-derived organoids identifies therapy-induced vulnerability in KRAS-mutant colon cancer.</a> Cell Rep. 42 (4), 112324 (2023).</li><li>Vandussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+BCL-G+regulates+secretion+of+inflammatory+chemokines+but+is+dispensable+for+induction+of+apoptosis+by+IFN-&#947;+and+TNF-&#945;+in+intestinal+epithelial+cells.">Human BCL-G regulates secretion of inflammatory chemokines but is dispensable for induction of apoptosis by IFN-&#947; and TNF-&#945; in intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Edgar, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-associated+DNA+methylation+changes+impact+on+cellular+function+of+human+intestinal+organoids.">Culture-associated DNA methylation changes impact on cellular function of human intestinal organoids.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (6), 1295-1310 (2022).</li><li>Mubaid, F., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Less+is+more:+Longer+exposure+times+with+low+light+intensity+is+less+photo-toxic.">Less is more: Longer exposure times with low light intensity is less photo-toxic.</a> Microscopy Today. 25 (6), 26-35 (2017).</li><li>Ziegler, U., Groscurth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+features+of+cell+death.">Morphological features of cell death.</a> News Physiol Sci. 19 (3), 124-128 (2004).</li><li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths.">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Res. 28 (1), 9-21 (2018).</li><li>Tamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+anticancer+agents+using+patient-derived+tumor+organoids+characteristically+similar+to+source+tissues.">Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues.</a> Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).</li><li>Karki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+of+TNF-&#945;+and+IFN-&#947;+triggers+inflammatory+cell+death,+tissue+damage,+and+mortality+in+SARS-CoV-2+infection+and+cytokine+shock+syndromes.">Synergism of TNF-&#945; and IFN-&#947; triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes.</a> Cell. 184 (1), 149-168.e17 (2021).</li><li>Geary, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+synergy.">Understanding synergy.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (3), E237-E253 (2013).</li><li>Duarte, D., Vale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+synergism+in+drug+combinations+and+reference+models+for+future+orientations+in+oncology.">Evaluation of synergism in drug combinations and reference models for future orientations in oncology.</a> Curr Res Pharmacol Drug Discov. 3, 100110 (2022).</li><li>Wong, F. C., Woo, C. C., Hsu, A., Tan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-cancer+activities+of+Vernonia+amygdalina+extract+in+human+breast+cancer+cell+lines+are+mediated+through+caspase-dependent+and+p53-independent+pathways.">The anti-cancer activities of Vernonia amygdalina extract in human breast cancer cell lines are mediated through caspase-dependent and p53-independent pathways.</a> PLoS One. 8 (10), e78021 (2013).</li><li>Ryall, K. A., Tan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+approaches+for+advancing+the+discovery+of+effective+drug+combinations.">Systems biology approaches for advancing the discovery of effective drug combinations.</a> J Cheminform. 7, 7 (2015).</li><li>Sukho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+seeding+density+and+inflammatory+cytokines+on+adipose+tissue-derived+stem+cells:+An+in+vitro+study.">Effect of cell seeding density and inflammatory cytokines on adipose tissue-derived stem cells: An in vitro study.</a> Stem Cell Rev Rep. 13 (2), 267-277 (2017).</li><li>Vaughan-Jackson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+dependent+regulation+of+inflammatory+responses+in+macrophages.">Density dependent regulation of inflammatory responses in macrophages.</a> Front Immunol. 13, 895488 (2022).</li><li>Lumibao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+extracellular+matrix+on+the+precision+medicine+utility+of+pancreatic+cancer+patient-derived+organoids.">The impact of extracellular matrix on the precision medicine utility of pancreatic cancer patient-derived organoids.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+induces+LGR5++stem+cell+dysfunction+in+patients+with+Crohn's+disease.">TNF&#945; induces LGR5+ stem cell dysfunction in patients with Crohn's disease.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (3), 789-808 (2022).</li></ol>

كان K.N. يتلقى تمويلا بحثيا من شركة AbbVie Inc. خلال الوقت الذي تم فيه الانتهاء من العمل. كان هذا التمويل في سياق جائزة مركز الأبحاث (SFI-14 / SP / 2710) إلى APC Microbiome Ireland.

تم تطوير عدة طرق للتحليلات الكمية لموت الخلايا في الكائنات العضوية المعوية. يعد فحص اضطراب مورفولوجيا الأعضاء المعوية بواسطة الفحص المجهري الضوئي نهجا مباشرا لتحديد آثار المواد السامة للخلايا11. ومع ذلك ، فإن التغيرات المورفولوجية ليست قياسا مباشرا لموت الخلايا ، والطريقة شبه كمية فقط. طريقة أخرى هي تقييم النشاط الأيضي العضوي باستخدام مقايسة MTT أو ATP 10,11. من المهم ملاحظة أن هذه المقايسات يمكنها فقط تحديد التغييرات في صلاحية الخلية ويجب التحقق من صحتها باستخدام مقايسة موت الخلية. تم الإبلاغ عن فحوصات موت الخلايا الفلورية الأخرى باستخدام أصباغ ربط الحمض النووي 12,13. من الممكن اتباع نهج غير تصويري باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية ويسمح بإنتاجية عالية12. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تقيس متوسط إشارة البئر بأكمله ، مما يجعلها غير مناسبة للسكان غير المتجانسين. كما يتطلب استخدام قارئ الصفائح الدقيقة مع تعديل ارتفاع Z. يمكن استخدام التقنيات القائمة على التصوير الفلوري لتحليل العضو المفرد والتقاط البيانات الخلوية / تحت الخلوية والمورفولوجية. يمكن لأنظمة التصوير الآلي عالي المحتوى (HCI) متحد البؤر توليد كميات كبيرة من البيانات بمعدل إنتاجية مرتفع13. لسوء الحظ ، يحتاج HCI متحد البؤر إلى معدات متخصصة ، ويستخدم بروتوكولات معقدة ، ويتطلب عادة برامج تحليل الصور التجارية ، وهو مكلف.
بروتوكولنا للتحليل الكمي لموت خلايا القولون في نقاط زمنية متعددة واضح وبسيط وغير مكلف. ومع ذلك ، بالمقارنة مع أنظمة HCI وقارئ اللوحات الآلية ، فإنها تستغرق وقتا طويلا وقد قللت من الإنتاجية. هناك قيد آخر لطريقتنا وهو استخدام المجال العريض بدلا من الفحص المجهري متحد البؤر. الفحص المجهري متحد البؤر هو أكثر ملاءمة لتصوير عينات 3D سميكة مثل المواد العضوية لأنه يقلل من إشارة خارج التركيز ويمكن الحصول على أقسام بصرية تسلسلية (Z-مداخن). ومع ذلك ، يتطلب التصوير البؤري عادة أوقات اكتساب أطول وأشعة ليزر عالية الكثافة تزيد من السمية الضوئية / التبييض الضوئي. من الأهمية بمكان ملاحظة أن أصباغ موت الخلايا الفلورية مثل SYTOX Green مناسبة فقط لقياس أشكال موت الخلايا حيث يوجد فقدان لسلامة غشاء الخلية مثل النخر ، والنخر الثانوي المرتبط بموت الخلايا المبرمج المتأخر ، والتنخر ، و pyroptosis21. هناك بعض أشكال موت الخلايا المنظم حيث يظل غشاء الخلية غير منفذ على الأقل خلال المراحل المبكرة من موت الخلايا ، مثل موت الخلايا المبرمج المعتمد على الكاسباس. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة ليشمل أيضا تصوير مراسل فلورسنت نشاط caspase 3/722. وهذا من شأنه أن يوفر بيانات إضافية للمساعدة في توصيف طريقة موت الخلية المحددة.
استخدمنا بروتوكولنا لإثبات التفاعل التآزري السام للخلايا بين السيتوكينات IFN-γ و TNF-α (الشكل 2C) ، والتي أبلغنا عنها سابقا في المواد العضوية المشتقة من المريضCD 9,10. كما تم إثبات الأهمية الفسيولوجية لهذا النوع من التآزر في نماذج الفئران من كثرة الخلايا اللمفاوية البلعمية والإنتان23. تم تنفيذ العديد من النماذج والنهج المرجعية الرياضية لقياس التآزر بين مجموعات العوامل البيولوجية24,25. وهي تختلف من حيث تعقيدها ، وعدد العوامل التي تأخذها في الاعتبار ، وعتبة اعتبار التفاعل تآزريا24,25. تحتاج بعض النماذج إلى معرفة مسبقة بالعوامل البيولوجية التي تم اختبارها ، وتضع افتراضات معينة حول نشاط العوامل ، ويمكن أن تتطلب منحنيات شاملة للجرعة والاستجابة لكل علاج فردي ومركب25. الطريقة التي اخترناها لقياس التآزر هي تعديل نموذج معامل التفاعل الدوائي (CDI) ، والذي تم استخدامه سابقا لقياس التأثيرات المثبطة لتركيبات أدوية العلاج الكيميائي على تكاثر خط الخلايا السرطانية26. CDI هو نموذج استقلال النعيم. عند حساب التأثير المشترك المتوقع لاثنين من الاضطرابات ، يفترض استقلال Bliss أنهما يستهدفان مسارات منفصلة ولديهما آليات عمل مستقلة27. لكي يكون التفاعل بين الاضطرابات تآزريا ، يجب أن يكون التأثير المشترك الفعلي أكبر من التأثير المتوقع. هذا النموذج مناسب لإعدادنا التجريبي حيث من المعروف أن IFN-γ و TNF-α لهما مستقبلات مختلفة ومكونات إشارات المصب. علاوة على ذلك ، يسمح استقلال Bliss بحساب معامل التفاعل لتحديد التآزر ولا يتطلب مجموعات بيانات استجابة الجرعة.
هناك بعض العوامل الرئيسية التي يجب مراعاتها لضمان النتائج المثلى لهذا البروتوكول. من المهم أن يتم نشر القولون إلى كثافة عالية (الشكل 1Bi) ، وأن يبلغ قطرها حوالي 25-50 ميكرومتر ، وتتكاثر بنشاط قبل محاولة زرع الخلايا. قد يؤدي استخدام الثقافات دون المستوى الأمثل للقولون للمقايسات إلى عدم كفاية أعداد الخلايا ، وانخفاض تعافي القولون ، وتجارب غير متسقة. للحصول على نتائج قابلة للتكرار ، من المهم أيضا زرع كثافة القولون باستمرار بين التجارب. لقد ثبت سابقا أن الاستجابة في المختبر للسيتوكينات الالتهابية يمكن أن تتأثر بكثافة بذر الخلايا28,29. مشكلة أخرى شائعة هي تكوين فقاعات الهواء في قبة BME ، والتي يمكن أن تؤثر على التصوير. يمكن منع ذلك باستخدام تقنية السحب العكسي. ينتج عن هذه التقنية أيضا بذر أكثر اتساقا.
علاوة على ذلك ، في حالة تصوير نقاط زمنية متعددة ، قم بإعداد حالة السمية القصوى لكل نقطة زمنية. يستخدم Triton-X 100 ، وهو خافض للتوتر السطحي غير أيوني ، بشكل شائع كعنصر تحكم إيجابي (حالة السمية القصوى) لمقايسات السمية الخلوية. إضافة Triton-X 100 lyses ويقتل القولون ، مما يسمح لصبغة موت الخلايا الفلورية بدخول الخلايا. سيؤدي استخدام حالة Max Toxicity من نقطة زمنية سابقة إلى تطبيع غير دقيق وغير متسق للبيانات بسبب تحلل إشارة الفلورسنت بمرور الوقت.
النقطة الأخيرة التي يجب مراعاتها هي اختيار BME المستخدم في ثقافة القولون. هناك العديد من المنتجين التجاريين ل BME. ومع ذلك ، بالنسبة لبروتوكولنا ، قمنا فقط باختبار العلامة التجارية المدرجة في جدول المواد. وجدت دراسة حديثة باستخدام عضويات سرطان البنكرياس المشتقة من المريض أن المصدر التجاري ل BME غير معدلات تكاثر الخلايا ولكن لم يكن له تأثير كبير على الاستجابة لأدوية العلاج الكيميائي أو التعبير الجيني30. مع وضع ذلك في الاعتبار ، نتوقع أن يكون اتجاه النتائج مشابها بين العلامات التجارية BME لبروتوكولنا ، لكننا نوصي باستخدام نفس العلامة التجارية باستمرار.
لقد أوضحنا كيف يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل موت الخلايا الناجم عن IFN-γ و TNF-α باستخدام القولون المشتق من CD. تعتبر العضويات المعوية المشتقة من المريض أداة قوية لدراسة CD لأنها تحتفظ بالعديد من خصائص المرض ، بما في ذلك زيادة الحساسية للتأثيرات السامة للخلايا ل TNF-α31. ومع ذلك ، يمكن تعديل البروتوكول بسهولة للتحقيق في التأثيرات السامة للخلايا للاضطرابات بخلاف السيتوكينات أو حالات المرض بخلاف مرض التهاب الأمعاء مثل سرطان القولون والمستقيم (لقد اختبرنا البروتوكول بنجاح باستخدام القولون غير الالتهابي). نعتقد أن هذه الطريقة مفيدة لأي مجال بحثي معني بآليات موت الخلايا أو وظيفة الحاجز الظهاري أو المناعة المخاطية المعوية.

تخلق ظهارة الأمعاء حاجزا ماديا شبه نافذ بين محتويات تجويف الأمعاء والأنسجة الكامنة. للحفاظ على هذا الحاجز بشكل فعال ، تخضع الخلايا الظهارية المعوية (IECs) لدوران خلوي مرتفع للغاية ، مع دورة مستمرة من موت الخلايا وتجديدها. ومع ذلك ، أثناء الاضطرابات الالتهابية ، مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) ، تحدث مستويات أعلى من موت الخلايا الشاذة1. هذا قد يعزز انهيار وظيفة الحاجز وتنشيط الجهاز المناعي ، مما يؤدي إلى مزيد من الالتهاب. في مرض كرون (CD) ، وهو شكل من أشكال مرض التهاب الأمعاء ، فقد ثبت أن إشارات السيتوكين تساهم في زيادة مستويات وفاة IEC2. من خلال دراسة كيفية تسبب إشارات السيتوكين في موت الخلايا في IECs ، من المأمول أن يتم تطوير علاجات محسنة للمرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء والاضطرابات الالتهابية المعوية الأخرى1.
في علم الأحياء وأبحاث اكتشاف هدف الدواء ، من المفهوم عموما أن التآزر يحدث عندما يظهر نظام بيولوجي معالج بمجموعات من المحفزات الفردية استجابة للتركيبة أكبر من التأثيرات المضافة المشتركة للمحفزات الفردية وحدها. تم توثيق التفاعلات التآزرية بين السيتوكينات بشكل جيد في قيادة الاستجابات الفطرية المضادة للفيروسات3. من المعروف أيضا أن السيتوكينات تحفز موت الخلايا بشكل تآزري ، بما في ذلك فيIECs 4. ومع ذلك ، فإن الدور الذي تلعبه إشارات السيتوكين السامة للخلايا التآزرية في الاضطرابات الالتهابية المعوية مثل مرض التهاب الأمعاء غير مدروس.
العضويات المعوية البشرية هي الأنسجة الدقيقة 3D المنتجة في المختبر التي يتم إنشاؤها من الخلايا الجذعية الظهارية المعوية. يمكن زراعة العضويات المعوية من خزعات الغشاء المخاطي في الأمعاء التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء والاحتفاظ بالعديد من خصائص المرض 5,6. أثبتت المواد العضوية أنها نظام نموذجي مثالي لدراسة السمية الخلوية للسيتوكين في سياق التهاب الأمعاء 7,8. في السابق ، وصفت مجموعتنا تأثيرات القتل التآزرية للسيتوكينات ذات الصلة ب IBD IFN-γ و TNF-α في عضويات القولون المشتقة من المريض CD (colonoids) 9,10. ومع ذلك ، فإن الآليات الدقيقة التي ينطوي عليها التوسط في هذا الشكل من موت الخلايا التآزري لا تزال بعيدة المنال. هناك أيضا العديد من تفاعلات السيتوكينات السامة للخلايا غير المميزة ذات الصلة بالاضطرابات الالتهابية المعوية.
تتوفر العديد من البروتوكولات لدراسة موت الخلايا في الكائنات العضوية المعوية10،11،12،13 ؛ ومع ذلك ، لكل منهم عيوب. بعض هذه التقنيات تقيس فقط صلاحية الخلية ولا تقيس موت الخلايا مباشرة ، أو غير قادرة على تقييم استجابات العضو الواحد ، أو تتطلب معدات باهظة الثمن وبروتوكولات معقدة. هناك حاجة إلى منهجيات قوية ومباشرة لتحديد موت الخلايا العضوية وتفاعلات الاضطراب في الكائنات العضوية المعوية. البروتوكول الذي نقدمه هو نهج بسيط وغير مكلف لقياس استجابات العضو الواحد للسيتوكينات السامة للخلايا ولكن يمكن استخدامه لأي نوع من التحفيز أو الاضطرابات. نوضح أيضا كيفية استخدام نموذج تآزر استقلال Bliss لحساب معامل تفاعل الاضطراب (CPI) الذي يصف تفاعلات السيتوكين السامة للخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B Solution</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>Science Suite Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scientific illustration software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>A2058</td>
			<td>Essentially IgG-free, low endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>SML1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td>Basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>Digital inverted epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS 40x Objective, fluorite, LWD, phase-contrast</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4683</td>
			<td>Long working distance 40x fluorescence objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ (Windows version)</td>
			<td>Open-source software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Solution</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td>Enzyme-free cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5 (Windows version)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data graphics and statistics software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner 15 mL Polypropylene Centrifuge Tube, Sterile with conical bottom &#38; Screw Cap</td>
			<td>Cruinn</td>
			<td>188261CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant EGF (animal free)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-05</td>
			<td>Broad range antimicrobial reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Edge 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15543115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF</td>
			<td>Resuspend in sterile filtered 0.1% PBS/BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA</td>
			<td>Resuspend in sterile filtered 0.1% PBS/BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green Nucleic Acid Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td>Fluorescent cell death dye, protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Merck</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Enzymatic dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10071</td>
			<td>Inhibitor of ROCK-I and ROCK-II</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cytokine-induced cell death in human colonic organoids using live fluorescence microscopy

يزداد موت الخلايا الظهارية المعوية (IEC) في المرضى الذين يعانون من أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) مثل التهاب القولون التقرحي (UC) ومرض كرون (CD). هذا يمكن أن يسهم في عيوب في وظيفة الحاجز المعوي ، وتفاقم الالتهاب ، والتسبب المناعي للمرض. السيتوكينات وروابط مستقبلات الموت مسؤولة جزئيا عن هذه الزيادة في وفيات IEC. السيتوكينات ذات الصلة ب IBD ، مثل TNF-α و IFN-γ ، سامة للخلايا ل IECs بشكل مستقل ومجتمعة. يصف هذا البروتوكول مقايسة بسيطة وعملية لتحديد السمية الخلوية التي يسببها السيتوكين في عضويات القولون المشتقة من المريض باستخدام صبغة موت الخلايا الفلورية (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) ، والمجهر الفلوري الحي ، وبرنامج تحليل الصور مفتوح المصدر. نوضح أيضا كيفية استخدام النموذج الرياضي لاستقلال Bliss لحساب معامل تفاعل الاضطراب (CPI) بناء على السمية الخلوية العضوية. يمكن استخدام مؤشر أسعار المستهلك لتحديد ما إذا كانت التفاعلات بين مجموعات السيتوكين أو أنواع أخرى من الاضطرابات معادية أو مضافة أو تآزرية. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول للتحقيق في النشاط السام للخلايا للسيتوكينات وغيرها من الاضطرابات باستخدام عضويات القولون المشتقة من المريض.

The intestinal epithelium creates a physical semipermeable barrier between the contents of the gut lumen and the underlying tissues. To maintain this barrier effectively, intestinal epithelial cells (IECs) undergo an extremely high cellular turnover, with a continuous cycle of cell death and regeneration. However, during inflammatory disorders, such as inflammatory bowel disease (IBD), higher levels of aberrant cell death occur1. This may promote a breakdown in barrier function and activation of the immune system, triggering further inflammation. In Crohn&#39;s disease (CD), a form of IBD, it has been shown that cytokine signaling contributes to the increased levels of IEC death2. By studying how cytokine signaling induces cell death of IECs, it is hoped that improved treatments can be developed for patients with IBD and other intestinal inflammatory disorders1.
In biology and drug target discovery research, synergy is generally understood to occur when a biological system treated with combinations of individual stimuli shows a response to the combination that is greater than the combined additive effects of the single stimuli alone. Synergistic interactions between cytokines have been well documented in driving innate antiviral responses3. Cytokines have also been known to induce cell death synergistically, including in IECs4. However, the role synergistic cytotoxic cytokine signaling plays in intestinal inflammatory disorders such as IBD is understudied.
Human intestinal organoids are 3D microtissues produced in vitro that are generated from intestinal epithelial stem cells. Intestinal organoids can be grown from gut mucosal biopsies obtained from patients with IBD and retain many characteristics of the disease5,6. Organoids have proven to be an ideal model system for studying cytokine cytotoxicity in the context of intestinal inflammation7,8. Previously, our group has characterized the synergistic killing effects of the IBD-relevant cytokines IFN-&#947; and TNF-&#945; in CD patient-derived colonic organoids (colonoids)9,10. However, the exact mechanisms involved in mediating this form of synergistic cell death remain elusive. There are also potentially many more uncharacterized cytotoxic cytokine interactions that are relevant to intestinal inflammatory disorders.
Several protocols are available to study cell death in intestinal organoids10,11,12,13; however, they each have drawbacks. Some of these techniques only measure cell viability and do not measure cell death directly, are incapable of evaluating single-organoid responses, or require expensive equipment and complex protocols. Robust and straightforward methodologies are needed to quantify organoid cell death and perturbagen interactions in intestinal organoids. The protocol we present is a simple and inexpensive approach to measure single-organoid responses to cytotoxic cytokines but can be used for any type of stimulus or perturbagen. We also demonstrate how to use the Bliss independence synergy model to calculate a coefficient of perturbagen interaction (CPI) that describes cytotoxic cytokine interactions.

تسليط الضوء على المؤلف: فهم موت الخلايا الناجم عن السيتوكين في الخلايا الظهارية المعوية والخلايا السرطانية باستخدام الكائنات العضوية البشرية

القياس الكمي لموت الخلايا الناجم عن السيتوكين في عضويات القولون البشري باستخدام الفحص المجهري الفلوري الحي

باستخدام هذا البروتوكول ، أوضحنا كيف يمكن استخدام القولون المريض CD لدراسة التأثيرات السامة للخلايا للسيتوكينات ذات الصلة ب IBD IFN-γ و TNF-α على الظهارة الأولية. استخدمنا صبغة موت الخلايا الفلورية المتاحة تجاريا (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) ، والتي يمكن أن تدخل فقط الخلايا التي تحتوي على غشاء خلوي مخترق حيث يتم تنشيطه بعد ذلك عن طريق الارتباط بالأحماض النووية. لقد عالجنا القولون باستخدام السيتوكينات وصبغة موت الخلايا الفلورية وأجرينا تصويرا للخلايا الحية في 8 ساعات و 24 ساعة باستخدام مجهر التألق المقلوب. تشير صور تراكب الإرسال / الفلورسنت التمثيلي عند 8 ساعات إلى أن القولون المعالج IFN-γ + TNF-α فقط هو الموجب لإشارة الفلورسنت ؛ ومع ذلك ، لا يوجد سوى عدد قليل من الخلايا الفلورية (الشكل 2 أ). يمكن أيضا ملاحظة نفخ الخلايا ، وهو مؤشر مورفولوجي لموت الخلايا20 ، في حالة IFN-γ + TNF-α. في 24 ساعة ، تظهر القولون المعالجة ب IFN-γ + TNF-α مناطق كبيرة إيجابية لإشارة الفلورسنت (الشكل 2 أ). هناك أيضا انهيار واضح في مورفولوجيا القولون - لم يعد التجويف المركزي مرئيا ، وقد تعطل الحاجز الظهاري تماما.
لتحديد إشارة صبغة موت الخلية ، استخدمنا برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر لحساب شدة الفلورسنت لكل قولون. ثم قمنا بتطبيع البيانات من خلال التعبير عن متوسط كل حالة كنسبة مئوية من علاج السمية القصوى. في 8 ساعات ، كان موت الخلايا التماثلية أو الخلفية في القولون الضابط BSA منخفضا نسبيا (7.7٪ من السمية القصوى) (الشكل 2 ب). لم تكن هناك تغييرات ذات دلالة إحصائية في مستويات موت الخلايا في هذه المرحلة الزمنية. ومع ذلك ، أظهرت الحالات التي عولجت بعامل نخر الورم - α زيادة طفيفة في السمية الخلوية (الشكل 2 ب). بعد 24 ساعة ، زادت مستويات موت الخلايا لجميع الحالات المعالجة بالسيتوكين. ومع ذلك ، كان هناك تغيير طفيف في موت الخلايا لحالة التحكم في BSA بين النقاط الزمنية (7.5٪ من السمية القصوى عند 24 ساعة). كان لدى القولون المعالج ب IFN-γ + TNF-α أكبر زيادة في مستويات موت الخلايا مقارنة بالتحكم في BSA (29.4٪ من السمية القصوى). كان الفرق في مستويات موت الخلايا بين العلاج المشترك وعلاجات السيتوكين المفردة (IFN-γ ، TNF-α) كبيرا للغاية. تشير هذه النتائج إلى إمكانية وجود تفاعل تآزري سام للخلايا بين IFN-γ و TNF-α عند 24 ساعة.
استخدمنا مؤشر أسعار المستهلك لتحديد التفاعلات السامة للخلايا بين علاجات السيتوكين وتحديد ما إذا كانت تآزرية. تعتبر التفاعلات بين السيتوكينات تآزرية عندما تكون قيمة مؤشر أسعار المستهلك <1 ، أو مضافة عندما = 1 ، أو معادية عندما تكون >1. قمنا بحساب قيم مؤشر أسعار المستهلك لكل نقطة زمنية (الشكل 2C). في 8 ساعات ، أشارت قيمة مؤشر أسعار المستهلكين إلى تآزر طفيف (0.99) ، مع انخفاض قيمة مؤشر أسعار المستهلك بشكل كبير عند 24 ساعة (0.83). وأكد هذا التحليل أن التفاعل بين IFN-γ و TNF-α في الساعة 24 كان تآزريا. وعلاوة على ذلك، فإنه يوضح كيف أن التآزر بين γ IFN- وTNF-α يعتمد على الوقت.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig01v2.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل التجريبي واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. (أ) نظرة عامة تخطيطية على البروتوكول. (ب) صور تمثيلية. (ثنائي) صورة مجهرية ضوئية توضح الكثافة المثلى للثقافة والحجم الأمثل للقولون قبل المرور للفحص. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (Bii) صورة مجهرية ضوئية توضح الحجم الأمثل لشظايا القولون بعد التفكك ؛ شظايا مظللة باللون الأحمر. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (Biii) صورة مجهرية ضوئية لمورفولوجيا القولون الميت بعد علاج MT (مع Triton X-100). شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (Biv) صورة مجهرية ضوئية لاثنين من القولون المتداخلة في نفس المستوى البؤري. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (Bv) صورة مجهرية ضوئية لحطام خلايا القولون الموجودة بعد المرور ؛ الحطام مظلل باللون الأحمر. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. الاختصارات: ROI = منطقة الاهتمام ؛ MFI = متوسط شدة التألق ؛ MT = أقصى سمية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig01largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig02v2.jpg"> الشكل 2: التحليل الكمي لموت الخلايا الناجم عن السيتوكين في القولون المضغوط البشري. (أ) صور مجهرية حية تمثيلية لقولون CD المعالج بصبغة الحمض النووي الأخضر SYTOX (صبغة موت الخلايا الفلورية) والسيتوكينات في 8 ساعات و 24 ساعة ؛ قنوات الإرسال و GFP (اللون الأخضر) متراكبة. تم التعامل مع القولون على النحو التالي: 1) PBS / BSA ، 2) 10 نانوغرام / مل IFN-γ ، 3) 10 نانوغرام / مل TNF-α ، 4) 10 نانوغرام / مل IFN-γ + 10 نانوغرام / مل TNF-α. قضبان المقياس = 25 ميكرومتر. (ب) التحليل الكمي للقولون CD المعالج بصبغة موت الخلايا الفلورية والسيتوكينات عند 8 و 24 ساعة ؛ يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من شرط MT. N = 2 خطوط قولون CD ، 11-16 قولون مصور لكل حالة. (C) يتم حساب مؤشر أسعار المستهلك لكل نقطة زمنية باستخدام مجموعة البيانات من B ، N = 2 خطوط القولون CD. يتم التعبير عن البيانات كوسيلة ± SE. في B ، تم إجراء تحليل ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا باختبارات Bonferroni اللاحقة ، * P < 0.05 ، ***P < 0.001 كما هو موضح. الاختصارات: CD = مرض كرون. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ CPI = معامل تفاعل الاضطراب ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ BSA = ألبومين مصل البقر ؛ TNF-α = عامل نخر الورم ألفا ؛ IFN-γ = إنترفيرون جاما ؛ MT = أقصى سمية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig02largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: تكوين وسائط الثقافة للبروتوكول. لتحضير وسائط الانتشار العضوية ، اجمع بين الوسائط المكيفة L-WRN والوسائط الخالية من المصل 1: 1 ، ثم أضف المكملات الغذائية. يجب استخدام وسائط الانتشار العضوية في غضون 2 أسابيع من التحضير. يرجى ملاحظة أنه يجب تخزين جميع الوسائط الكاملة عند 4 درجات مئوية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 2: تخطيط لوحة 96 بئرا التجريبية وعلاجات السيتوكينات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%202%20(1).xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة للتحقيق في موت الخلايا وقياسه في عضويات القولون البشرية استجابة للاضطرابات السامة للخلايا مثل السيتوكينات. يستخدم هذا النهج صبغة موت الخلايا الفلورية (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) ، والمجهر الفلوري الحي ، وبرنامج تحليل الصور مفتوح المصدر لتحديد الاستجابات العضوية المفردة للمنبهات السامة للخلايا.

Intestinal epithelial cell (IEC) death is increased in patients with inflammatory bowel diseases (IBD) such as ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease ...

quantification-cytokine-induced-cell-death-human-colonic-organoids

القياس الكمي لموت الخلايا الناجم عن السيتوكين في عضويات القولون البشري باستخدام الفحص المجهري الفلوري الحي

Abstract