Questo protocollo descrive un metodo semplice ed economico per studiare e quantificare la morte cellulare negli organoidi del colon umano in risposta a perturbageni citotossici come le citochine. L'approccio impiega un colorante fluorescente per la morte cellulare (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), la microscopia a fluorescenza dal vivo e un software di analisi delle immagini open source per quantificare le risposte di singoli organoidi a stimoli citotossici.
La morte delle cellule epiteliali intestinali (IEC) è aumentata nei pazienti con malattie infiammatorie intestinali (IBD) come la colite ulcerosa (UC) e il morbo di Crohn (CD). Ciò può contribuire a difetti nella funzione della barriera intestinale, esacerbazione dell'infiammazione e immunopatogenesi della malattia. Le citochine e i ligandi del recettore della morte sono parzialmente responsabili di questo aumento della morte per IEC. Le citochine rilevanti per le IBD, come il TNF-α e l'IFN-γ, sono citotossiche per le IEC sia indipendentemente che in combinazione. Questo protocollo descrive un test semplice e pratico per quantificare la citotossicità indotta da citochine in organoidi del colon derivati da pazienti con CD utilizzando un colorante fluorescente per la morte cellulare (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), microscopia a fluorescenza dal vivo e software di analisi delle immagini open source. Dimostriamo anche come utilizzare il modello matematico di indipendenza di Bliss per calcolare un coefficiente di interazione perturbagena (CPI) basato sulla citotossicità degli organoidi. Il CPI può essere utilizzato per determinare se le interazioni tra combinazioni di citochine o altri tipi di perturbageni sono antagoniste, additive o sinergiche. Questo protocollo può essere implementato per studiare l'attività citotossica di citochine e altri perturbageni utilizzando organoidi del colon derivati da pazienti.
L'epitelio intestinale crea una barriera fisica semipermeabile tra il contenuto del lume intestinale e i tessuti sottostanti. Per mantenere efficacemente questa barriera, le cellule epiteliali intestinali (IEC) subiscono un turnover cellulare estremamente elevato, con un ciclo continuo di morte e rigenerazione cellulare. Tuttavia, durante i disturbi infiammatori, come la malattia infiammatoria intestinale (IBD), si verificano livelli più elevati di morte cellulare aberrante1. Ciò può favorire un'interruzione della funzione di barriera e dell'attivazione del sistema immunitario, innescando un'ulteriore infiammazione. Nella malattia di Crohn (CD), una forma di IBD, è stato dimostrato che la segnalazione delle citochine contribuisce all'aumento dei livelli di morte per IEC2. Studiando come la segnalazione delle citochine induce la morte cellulare delle IEC, si spera che possano essere sviluppati trattamenti migliori per i pazienti con IBD e altri disturbi infiammatori intestinali1.
In biologia e nella ricerca sulla scoperta di bersagli farmacologici, la sinergia è generalmente intesa quando un sistema biologico trattato con combinazioni di stimoli individuali mostra una risposta alla combinazione che è maggiore degli effetti additivi combinati dei singoli stimoli da soli. È stato ben documentato che le interazioni sinergiche tra citochine guidano le risposte antivirali innate3. È anche noto che le citochine inducono sinergicamente la morte cellulare, anche nelle IEC4. Tuttavia, il ruolo sinergico della segnalazione citotossica delle citochine nei disturbi infiammatori intestinali come l'IBD è poco studiato.
Gli organoidi intestinali umani sono microtessuti 3D prodotti in vitro che vengono generati da cellule staminali epiteliali intestinali. Gli organoidi intestinali possono essere coltivati da biopsie della mucosa intestinale ottenute da pazienti con IBD e conservano molte caratteristiche della malattia 5,6. Gli organoidi hanno dimostrato di essere un sistema modello ideale per lo studio della citotossicità delle citochine nel contesto dell'infiammazione intestinale 7,8. In precedenza, il nostro gruppo ha caratterizzato gli effetti di uccisione sinergica delle citochine rilevanti per le IBD IFN-γ e TNF-α in organoidi del colon derivati da pazienti con MC (colonoidi)9,10. Tuttavia, gli esatti meccanismi coinvolti nella mediazione di questa forma di morte cellulare sinergica rimangono sfuggenti. Ci sono anche potenzialmente molte altre interazioni citotossiche citotossiche non caratterizzate che sono rilevanti per i disturbi infiammatori intestinali.
Sono disponibili diversi protocolli per studiare la morte cellulare negli organoidi intestinali 10,11,12,13; Tuttavia, ognuno di essi presenta degli svantaggi. Alcune di queste tecniche misurano solo la vitalità cellulare e non misurano direttamente la morte cellulare, non sono in grado di valutare le risposte di singoli organoidi o richiedono attrezzature costose e protocolli complessi. Sono necessarie metodologie robuste e semplici per quantificare la morte cellulare degli organoidi e le interazioni perturbagene negli organoidi intestinali. Il protocollo che presentiamo è un approccio semplice ed economico per misurare le risposte di singoli organoidi alle citochine citotossiche, ma può essere utilizzato per qualsiasi tipo di stimolo o perturbageno. Dimostriamo anche come utilizzare il modello di sinergia dell'indipendenza di Bliss per calcolare un coefficiente di interazione perturbagena (CPI) che descrive le interazioni citotossiche delle citochine.
Le biopsie della mucosa del colon sono state raccolte da pazienti con MC sottoposti a colonscopia di routine come parte dello standard di cura. L'approvazione etica per l'uso di campioni di tessuto dei pazienti e la generazione di linee di organoidi del colon da questi campioni è stata ottenuta dal Comitato Etico per la Ricerca Clinica degli Ospedali Universitari di Cork (CREC). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti in accordo con la Dichiarazione di Helsinki. Tutto il lavoro di coltura tissutale con biopsie e colonoidi del paziente deve essere eseguito all'interno di una cabina di biosicurezza seguendo i protocolli di sicurezza BSL2. Assicurarsi che tutta l'usura della plastica sia sterile prima dell'uso. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti, gli strumenti e il software utilizzati in questo protocollo.
I protocolli utilizzati dal nostro gruppo per l'isolamento delle cripte e la coltura di organoidi sono stati adattati dai metodi stabiliti 14,15,16 e sono stati pubblicati in precedenza 9,10,17. Per il seguente protocollo, i colonoidi sono stati coltivati utilizzando terreni di proliferazione degli organoidi (Tabella 1). I colonoidi coltivati utilizzando i terreni di proliferazione degli organoidi sono indifferenziati e arricchiti per le cellule staminali del colon. Il componente principale dei terreni di proliferazione degli organoidi è il 50% di terreno condizionato con L-WRN, che contiene i fattori di crescita della nicchia delle cellule staminali intestinali Wnt-3A (W), R-spondina 3 (R) e Noggin (N)15. I terreni di proliferazione degli organoidi vengono preparati combinando terreni condizionati con L-WRN e terreni privi di siero 1:1, seguiti da un'integrazione con nicotinamide e inibitori chimici (Tabella 1).
1. Isolamento delle cripte del colon e coltura colonoide
2. Preparazione di colonoidi per il saggio di morte cellulare
NOTA: Il protocollo del test di morte cellulare richiede 4 giorni per essere completato (Figura 1A).
3. Trattamenti colonoidi per il saggio della morte cellulare
4. Acquisizione delle immagini
5. Analisi delle immagini
6. Calcolo della tossicità massima %
7. Calcolo dell'IPC
Utilizzando questo protocollo, abbiamo dimostrato come i colonoidi dei pazienti affetti da CD possano essere utilizzati per studiare gli effetti citotossici delle citochine rilevanti per le IBD IFN-γ e TNF-α sull'epitelio primario. Abbiamo utilizzato un colorante fluorescente per la morte cellulare disponibile in commercio (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), che può entrare solo nelle cellule che hanno una membrana cellulare compromessa dove viene poi attivato legandosi agli acidi nucleici. Abbiamo co-trattato i colonoidi con citochine e il colorante fluorescente per la morte cellulare e abbiamo eseguito l'imaging di cellule vive a 8 ore e 24 ore con un microscopio a epifluorescenza invertita. Le immagini rappresentative di trasmissione/sovrapposizione fluorescente a 8 ore indicano che solo i colonoidi trattati con IFN-γ + TNF-α sono positivi per il segnale fluorescente; tuttavia, c'è solo un piccolo numero di celle fluorescenti (Figura 2A). Il blebbing cellulare, un indicatore morfologico della morte cellulare20, può essere osservato anche nella condizione IFN-γ + TNF-α. A 24 ore, i colonoidi trattati con IFN-γ + TNF-α mostrano ampie regioni positive per il segnale fluorescente (Figura 2A). C'è anche una chiara rottura nella morfologia del colonide: il lume centrale non è più visibile e la barriera epiteliale è stata completamente interrotta.
Per quantificare il segnale del colorante di morte cellulare, abbiamo utilizzato un software di analisi delle immagini open source per calcolare l'intensità fluorescente di ciascun colonoide. Abbiamo quindi normalizzato i dati esprimendo la media di ciascuna condizione come percentuale del trattamento di massima tossicità. A 8 ore, la morte cellulare omeostatica o di fondo nei colonoidi di controllo BSA era relativamente bassa (7,7% della tossicità massima) (Figura 2B). Non ci sono stati cambiamenti statisticamente significativi nei livelli di morte cellulare in questo momento; tuttavia, le condizioni trattate con TNF-α mostrato un piccolo aumento della citotossicità (Figura 2B). Dopo 24 ore, i livelli di morte cellulare erano aumentati per tutte le condizioni trattate con citochine. Tuttavia, c'è stato un cambiamento minimo nella morte cellulare per la condizione di controllo BSA tra i punti temporali (7,5% della tossicità massima a 24 ore). I colonoidi trattati con IFN-γ + TNF-α hanno avuto il maggiore aumento dei livelli di morte cellulare rispetto al controllo BSA (29,4% della tossicità massima). La differenza nei livelli di morte cellulare tra il trattamento combinato e i trattamenti con citochine singole (IFN-γ, TNF-α) è stata molto significativa. Questi risultati suggeriscono la possibilità di un'interazione sinergica citotossica tra IFN-γ e TNF-α a 24 ore.
Abbiamo utilizzato il CPI per quantificare le interazioni citotossiche tra i trattamenti con citochine e per determinare se fossero sinergiche. Le interazioni tra citochine sono considerate sinergiche quando il valore CPI è <1, additive quando =1 o antagoniste quando >1. Abbiamo calcolato i valori dell'IPC per punto temporale (Figura 2C). A 8 ore, il valore dell'IPC indicava un leggero sinergismo (0,99), con il valore dell'IPC che diminuiva sostanzialmente a 24 ore (0,83). Questa analisi ha confermato che l'interazione tra IFN-γ e TNF-α a 24 ore era sinergica. Inoltre, illustra come in questo contesto la sinergia tra IFN-γ e TNF-α sia dipendente dal tempo.
Figura 1: Schema del flusso di lavoro sperimentale e risoluzione dei problemi. (A) Panoramica schematica del protocollo. (B) Immagini rappresentative. (Bi) Immagine al microscopio ottico che illustra la densità ottimale della coltura e la dimensione ottimale dei colonoidi prima del passaggio per un test. Barra della scala = 500 μm. (Bii) Immagine al microscopio ottico che illustra la dimensione ottimale dei frammenti di colonoide dopo la dissociazione; Frammenti evidenziati in rosso. Barra della scala = 100 μm. (Biii) Immagine al microscopio ottico della morfologia del colonoide necrotico dopo trattamento MT (con Triton X-100). Barra della scala = 25 μm. (Biv) Immagine al microscopio ottico di due colonoidi sovrapposti sullo stesso piano focale. Barra della scala = 25 μm. (Bv) Immagine al microscopio ottico di detriti di cellule colonoidi presenti dopo il passaggio; detriti evidenziati in rosso. Barra della scala = 25 μm. Abbreviazioni: ROI = regione di interesse; MFI = intensità media della fluorescenza; MT = Tossicità massima. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi quantitativa della morte cellulare indotta da citochine nei colonoidi umani di CD. (A) Immagini rappresentative al microscopio dal vivo di colonoidi di CD trattati con SYTOX Green Nucleic Acid Stain (colorante fluorescente per la morte cellulare) e citochine a 8 ore e 24 ore; canali di trasmissione e GFP (colore verde) sovrapposti. I colonoidi sono stati trattati come segue: 1) PBS/BSA, 2) 10 ng/mL di IFN-γ, 3) 10 ng/mL di TNF-α, 4) 10 ng/mL di IFN-γ + 10 ng/mL di TNF-α. Barre della scala = 25 μm. (B) Analisi quantitativa di colonoidi CD trattati con il colorante fluorescente a morte cellulare e citochine a 8 e 24 ore; i dati sono espressi in % della condizione MT. N = 2 linee colonoidi CD, 11-16 colonoidi per condizione. (C) CPI calcolato per punto temporale utilizzando il set di dati da B, N = 2 linee colonoidi CD. I dati sono espressi come mezzi ± SE. In B, è stata eseguita l'analisi ANOVA a due vie seguita dai post-test di Bonferroni, *P < 0,05, ***P < 0,001 come indicato. Abbreviazioni: CD = Morbo di Crohn; GFP = proteina fluorescente verde; CPI = coefficiente di interazione perturbagena; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; BSA = albumina sierica bovina; TNF-α = fattore di necrosi tumorale-alfa; IFN-γ = interferone-gamma; MT = Tossicità massima. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Composizione dei terreni di coltura per il protocollo. Per preparare i terreni di proliferazione degli organoidi, combinare i terreni condizionati con L-WRN e i terreni senza siero 1:1, quindi aggiungere gli integratori. I terreni di proliferazione degli organoidi devono essere utilizzati entro 2 settimane dalla preparazione. Si prega di notare che tutti i supporti completi devono essere conservati a 4 °C. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Layout sperimentale della piastra a 96 pozzetti e trattamenti con citochine. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Sono stati sviluppati diversi metodi per l'analisi quantitativa della morte cellulare negli organoidi intestinali. L'esame dell'alterazione della morfologia degli organoidi intestinali mediante microscopia ottica è un approccio semplice per quantificare gli effetti delle sostanze citotossiche11. Tuttavia, i cambiamenti morfologici non sono una misura diretta della morte cellulare e il metodo è solo semiquantitativo. Un altro metodo consiste nel valutare l'attività metabolica degli organoidi utilizzando un test MTT o ATP10,11. È importante notare che questi test possono determinare solo i cambiamenti nella vitalità cellulare e devono essere convalidati con un test di morte cellulare. Sono stati riportati altri saggi fluorometrici di morte cellulare con coloranti leganti il DNA12,13. È possibile un approccio non di imaging che utilizza un lettore di micropiastre fluorescente e consente un'elevata produttività12. Tuttavia, questo metodo misura il segnale medio di un intero pozzo, rendendolo inadatto a popolazioni eterogenee. Richiede inoltre l'uso di un lettore di micropiastre con regolazione dell'altezza Z. Le tecniche basate sull'imaging fluorescente possono essere utilizzate per l'analisi di singoli organoidi e per l'acquisizione di dati cellulari/subcellulari e morfologici. I sistemi automatizzati di imaging confocale ad alto contenuto (HCI) possono generare grandi quantità di dati a un throughput elevato13. Sfortunatamente, l'HCI confocale necessita di apparecchiature specializzate, utilizza protocolli complessi, in genere richiede un software di analisi delle immagini commerciale ed è costosa.
Il nostro protocollo per l'analisi quantitativa della morte delle cellule colonoidi in più punti temporali è diretto, semplice ed economico. Tuttavia, rispetto ai sistemi automatizzati di lettura HCI e piastre, richiede molto tempo e ha una produttività ridotta. Un altro limite del nostro metodo è l'uso della microscopia a campo largo rispetto alla microscopia confocale. La microscopia confocale è più adatta per l'imaging di campioni 3D spessi come gli organoidi, in quanto riduce il segnale sfocato e può acquisire sezioni ottiche seriali (Z-stack). Tuttavia, l'imaging confocale richiede in genere tempi di acquisizione più lunghi e laser ad alta intensità che aumentano la fototossicità/fotosbiancamento. È fondamentale notare che i coloranti fluorescenti per la morte cellulare come SYTOX Green sono adatti solo per misurare forme di morte cellulare in cui vi è perdita di integrità della membrana cellulare come la necrosi, la necrosi secondaria associata all'apoptosi tardiva, la necroptosi e la piroptosi21. Esistono alcune forme di morte cellulare regolata in cui la membrana cellulare rimane impermeabile almeno durante le prime fasi della morte cellulare, come l'apoptosi caspasi-dipendente. Tuttavia, questo protocollo potrebbe essere facilmente modificato per incorporare anche l'imaging di un reporter fluorescente con attività caspasi 3/722. Ciò fornirebbe ulteriori dati per aiutare a caratterizzare la specifica modalità di morte cellulare.
Abbiamo utilizzato il nostro protocollo per dimostrare l'interazione sinergica citotossica tra le citochine IFN-γ e TNF-α (Figura 2C), che abbiamo precedentemente riportato in pazienti CD-derived organoids 9,10. La rilevanza fisiologica di questa forma di sinergismo è stata dimostrata anche in modelli murini di linfoistiocitosi emofagocitaria e sepsi23. Diversi modelli e approcci matematici di riferimento sono stati implementati per quantificare la sinergia tra combinazioni di agenti biologici 24,25. Differiscono in termini di complessità, numero di fattori che considerano e soglia per considerare sinergica un'interazione24,25. Alcuni modelli richiedono una conoscenza preliminare degli agenti biologici testati, fanno determinate ipotesi sull'attività degli agenti e possono richiedere curve dose-risposta complete per ogni trattamento singolo e combinato25. Il metodo che abbiamo scelto per misurare la sinergia è una modifica del modello del coefficiente di interazione farmacologica (CDI), che è stato precedentemente utilizzato per misurare gli effetti inibitori delle combinazioni di farmaci chemioterapici sulla proliferazione delle linee cellulari tumorali26. Il CDI è un modello di indipendenza Bliss; nel calcolare l'effetto combinato previsto di due perturbagenti, l'indipendenza di Bliss assume che essi mirino a percorsi separati e abbiano meccanismi d'azione indipendenti27. Affinché un'interazione tra perturbageni sia sinergica, l'effetto combinato effettivo deve essere maggiore dell'effetto previsto. Questo modello è appropriato per la nostra configurazione sperimentale poiché IFN-γ e TNF-α sono noti per avere recettori e componenti di segnalazione a valle diversi. Inoltre, l'indipendenza di Bliss consente il calcolo di un coefficiente di interazione per quantificare il sinergismo e non richiede set di dati dose-risposta.
Ci sono alcuni fattori chiave che devono essere considerati per garantire risultati ottimali per questo protocollo. È importante che i colonoidi siano propagati ad alta densità (Figura 1Bi), che abbiano un diametro di circa 25-50 μm e che stiano proliferando attivamente prima di tentare di seminare le cellule. L'uso di colture non ottimali di colonoidi per i saggi può comportare un numero insufficiente di cellule, un basso recupero di colonoidi ed esperimenti incoerenti. Per ottenere risultati riproducibili, è anche importante seminare la densità dei colonoidi in modo coerente tra gli esperimenti. È stato precedentemente dimostrato che la risposta in vitro alle citochine infiammatorie può essere influenzata dalla densità di semina cellulare28,29. Un altro problema comune è la formazione di bolle d'aria nella cupola BME, che possono influenzare l'imaging. Questo può essere evitato utilizzando la tecnica del pipettaggio inverso. Questa tecnica si traduce anche in una semina più coerente.
Inoltre, se si esegue l'imaging di più punti temporali, preparare una condizione di tossicità massima per ogni punto temporale. Triton-X 100, un tensioattivo non ionico, è comunemente usato come controllo positivo (condizione di massima tossicità) per i saggi di citotossicità. L'aggiunta di Triton-X 100 lisa e uccide i colonoidi, consentendo al colorante fluorescente di morte cellulare di entrare nelle cellule. L'utilizzo di una condizione di tossicità massima da un punto temporale precedente comporterà una normalizzazione imprecisa e incoerente dei dati a causa del decadimento del segnale fluorescente nel tempo.
Un ultimo punto da considerare è la scelta del BME utilizzato per la coltura colonoide. Esistono diversi produttori commerciali di BME; tuttavia, per il nostro protocollo, abbiamo testato solo il marchio incluso nella Tabella dei Materiali. Un recente studio che ha utilizzato organoidi di cancro al pancreas derivati da pazienti ha scoperto che la fonte commerciale di BME altera i tassi di proliferazione cellulare, ma non ha avuto alcun effetto significativo sulla risposta ai farmaci chemioterapici o sull'espressione genica30. Con questo in mente, ci aspettiamo che l'andamento dei risultati sia simile tra i marchi BME per il nostro protocollo, ma consigliamo di utilizzare lo stesso marchio in modo coerente.
Abbiamo dimostrato come questo protocollo possa essere utilizzato per l'analisi della morte cellulare indotta da IFN-γ e TNF-α utilizzando colonoidi derivati da pazienti con CD. Gli organoidi intestinali derivati da pazienti sono un potente strumento per studiare la MC in quanto conservano molte caratteristiche della malattia, tra cui una maggiore sensibilità agli effetti citotossici del TNF-α31. Tuttavia, il protocollo potrebbe essere facilmente modificato per studiare gli effetti citotossici di perturbageni diversi dalle citochine o stati patologici diversi dall'IBD come il cancro del colon-retto (abbiamo testato con successo il protocollo utilizzando colonoidi non-IBD). Riteniamo che questo metodo sia utile per qualsiasi area di ricerca riguardante i meccanismi di morte cellulare, la funzione della barriera epiteliale o l'immunologia della mucosa intestinale.
Gli autori desiderano ringraziare i pazienti per il loro consenso informato e la partecipazione allo studio di ricerca, e il personale clinico per la loro eccellente assistenza. La Figura 1A è stata creata con BioRender.com. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Science Foundation Ireland, in particolare un premio per lo sviluppo della carriera (CDA) a K.N. (SFI-13/CDA/2171), una sovvenzione per un centro di ricerca (SFI-12/RC/2273) e un premio per i raggi del centro di ricerca (SFI-14/SP/2710) ad APC Microbiome Ireland. P.F. ha anche ricevuto finanziamenti da SFI/20/RP/9007.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Merck | A2942 | |
A-83-01 | Sigma-Merck | SML0788 | |
BioRender | Science Suite Inc. | N/A | Scientific illustration software |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Merck | A2058 | Essentially IgG-free, low endotoxin |
B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
CHIR-99021 | Sigma-Merck | SML1046 | |
Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
Cultrex Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3532-010-02 | Basement membrane extract |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Merck | D2650 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Merck | D8537 | |
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope | Invitrogen | AMF4300 | Digital inverted epifluorescence microscope |
EVOS 40x Objective, fluorite, LWD, phase-contrast | ThermoFisher Scientific | AMEP4683 | Long working distance 40x fluorescence objective |
Fiji/ImageJ (Windows version) | Open-source software | N/A | Image analysis software |
Foetal Bovine Serum | Sigma-Merck | F9665 | |
Gentamicin Solution | Sigma-Merck | G1397 | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | Enzyme-free cell dissociation reagent |
GlutaMAX-1 | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement |
GraphPad Prism 5 (Windows version) | Dotmatics | N/A | Data graphics and statistics software |
Greiner 15 mL Polypropylene Centrifuge Tube, Sterile with conical bottom & Screw Cap | Cruinn | 188261CI | |
HEPES 1 M | Gibco | 15630080 | |
Human recombinant EGF (animal free) | Peprotech | AF-100-15 | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Merck | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Merck | N0636 | |
Normocin | InvivoGen | ant-nr-05 | Broad range antimicrobial reagent |
Nunc Edge 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 15543115 | |
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
Recombinant Human IFN-gamma Protein | R&D Systems | 285-IF | Resuspend in sterile filtered 0.1% PBS/BSA |
Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA | Resuspend in sterile filtered 0.1% PBS/BSA |
SB202190 | Sigma-Merck | S7067 | |
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 3451 | |
SYTOX Green Nucleic Acid Stain - 5 mM Solution in DMSO | Invitrogen | S7020 | Fluorescent cell death dye, protect from light |
Triton X-100 | Sigma-Merck | 93420 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Merck | T8154 | |
Tryple Express | Gibco | 12604013 | Enzymatic dissociation reagent |
Y-27632 | MedChemExpress | HY-10071 | Inhibitor of ROCK-I and ROCK-II |
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