利用恒定气压对针头开口进行湿式坡口

Summary

该协议描述了气动系统的组装，用于在针坡口过程中将加压空气输送到针头。该协议进一步描述了创建锋利的显微注射针的斜面过程以及如何测量针头的相对开口尺寸。

Abstract

显微注射针是将基因组修饰试剂、CRISPR 组分（向导 RNA、Cas9 蛋白和供体模板）和转座子系统组分（质粒和转座酶 mRNA）递送到发育中的昆虫胚胎中的关键工具。锋利的显微注射针在输送这些修饰剂时尤为重要，因为它们有助于最大限度地减少对被注射胚胎的损伤，从而与使用非斜面针头注射相比，提高这些胚胎的存活率。此外，针头的斜面产生的针头在针头之间更加一致，而不是通过刷尖端摩擦物体（盖玻片的侧面、要注射的胚胎表面等）来随机折断针尖而打开的针头。用输送到针头的恒压空气对显微注射针进行湿式斜切的过程使斜切针头的人可以知道针头何时打开（存在气泡），并且还可以相对指示针头开口的大小。针头中的相对开口尺寸可以通过调整输送到针头的气压来确定，直到达到平衡并且气泡停止从针尖流出。达到平衡的压力越低，针的尺寸就越大;相反，压力越高，针尺寸越小。

Introduction

昆虫基因改造是 Rubin 和 Spradling 最初在果蝇中开发的一个过程，多年来，这个过程已被修改以在其他物种中产生基因改造¹。该过程依赖于在发育中的胚胎内的特定时间和位置将修饰成分显微注射到胚胎中 ^2,3,4。锋利的显微注射针是某些昆虫（如蚊子^{4、5、6、7、8、9} 和沙蝇¹⁰）基因改造过程中的关键工具，而对其他昆虫（如蚕¹¹）则不那么重要。在尝试创造转基因昆虫时，锋利的针头通常是成功与失败的关键因素 ^2,4。通常，通过将玻....

Protocol

注：如下所述的方案使用 Sutter BV-10 微毛细管斜面。但是，可以修改该协议以用于任何型号的微毛细管斜面。

1. 调节器、压力表和供气管的组装

1. 剪下一段聚氨酯管，用于从气源到调节器底座 （R;第 1 节， 图 1）。该部分的长度将取决于从空气供应到位于坡口旁边的调节器的距离。
2. 将软管夹滑到聚氨?.......

Discussion

蚊子的基因改造依赖于将修饰材料（质粒、向导 RNA 或蛋白质）精确显微注射到胚层前胚胎中 3,4,5,6,7,8。这个过程的关键是锋利的针头，在注射过程中很容易刺穿胚胎 ^2,4。锋利的.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050