Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר הרכבה של מערכת פנאומטית להעברת אוויר בלחץ למחט במהלך תהליך שיקוע המחט. הפרוטוקול מתאר גם את תהליך השיקוע ליצירת מחטי מיקרו-הזרקה חדות וכיצד לאמוד את גודל הפתיחה היחסי של המחט.

Abstract

מחטי מיקרו-הזרקה הן כלי קריטי בהעברת ריאגנטים לשינוי גנום, רכיבי CRISPR (רנ"א מנחה, חלבון Cas9 ותבנית תורם), ורכיבי מערכת טרנספוזון (פלסמידים וטרנספוזאז mRNA) לעוברי חרקים מתפתחים. מחטי מיקרו-הזרקה חדות חשובות במיוחד במהלך הלידה של חומרים משנים אלה מכיוון שהן מסייעות למזער את הנזק לעובר המוזרק, ובכך להגדיל את הישרדותם של עוברים אלה בהשוואה להזרקה עם מחטים שאינן משופעות. יתר על כן, שיקוע המחטים מייצר מחטים עקביות יותר ממחט למחט בהשוואה למחטים הנפתחות על ידי שבירה אקראית של קצה המחט על ידי הברשה של קצה המחט כנגד חפץ (צד של כיסוי, פני השטח של העובר שיש להזריק וכו '). תהליך השיקוע הרטוב של מחטי מיקרו-הזרקה עם אוויר בלחץ קבוע המועבר למחט מאפשר לאדם המשופע את המחט לדעת מתי המחט פתוחה (נוכחות של בועות) וגם נותן אינדיקציה יחסית לגודל פתח המחט שנוצר. ניתן לקבוע את גודל הפתח היחסי במחט על ידי התאמת לחץ האוויר המועבר למחט עד להשגת שיווי משקל ובועות מפסיקות לזרום מקצה המחט. ככל שהלחץ שבו מגיעים לשיווי המשקל נמוך יותר, כך גודל המחט גדול יותר; ולהפך, ככל שהלחץ גבוה יותר, כך גודל המחט קטן יותר.

Introduction

שינוי גנטי של חרקים הוא תהליך שפותח במקור בדרוזופילה על ידי רובין וספרדלינג, ובמהלך השנים תהליך זה שונה ליצירת שינויים גנטיים במינים אחרים1. התהליך מסתמך על מסירה מדויקת של רכיבי שינוי המוזרקים במיקרו לעוברים בחלון זמן ומיקום מסוים בתוך העובר המתפתח 2,3,4. מחטי מיקרו-הזרקה חדות הן כלי קריטי בתהליך השינוי הגנטי של חרקים מסוימים, כגון יתושים 4,5,6,7,8,9 וזבובי חול10, בעוד שהן פחות קריטיות עבור חרקים אחרים, כגון תולעי ....

Protocol

הערה: הפרוטוקול כמתואר להלן משתמש במיקרו-נימי Sutter BV-10 משופע. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות שונה לשימוש עם כל מודל microcapillary משופע.

1. הרכבה של ווסת, מד לחץ וצינורות אספקת אוויר

  1. חותכים קטע של צינורות אורתן לחיבור מאספקת האוויר לבסיס הרגולטור (R; ס?.......

Representative Results

ההליך המתואר לעיל מייצר מחטי מיקרו-הזרקה חדות באופן עקבי. מחטים חדות מאופיינות בכך שהן מסוגלות להחדיר לעוברי חרקים כוריון רכים, כגון עוברי יתושים, עם התנגדות מועטה או ללא התנגדות מקרום העובר. כאשר עוברים של יתושים מוזרקים במיקרו לצורך שינוי גנטי, קרום העובר אלסטי יחסית. ?.......

Discussion

שינוי גנטי של יתושים מסתמך על מיקרו-הזרקה מדויקת של חומרי השינוי (פלסמידים, רנ"א מנחה או חלבונים) לעוברים קדם-בלסטודרם 3,4,5,6,7,8. קריטיות לתהליך זה הן מחטים חדות המנק.......

Acknowledgements

המחבר רוצה להכיר את האנשים הבאים. צוות המתקן לשינוי חרקים באוניברסיטת מרילנד: חנה אלוביהארה, רוברט אלפורד ודניאל גיי. ללא עבודתם המסורה, מתקן טרנספורמציית החרקים לא היה קיים. ונסה מלדנר-הארל על הגהה של כתב היד.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.0 mm O.D. microcapillariesWorld Precision Instruments
Beveler pedestal oilSutter Instruments008
Bicycle fender clipVeloOrangeR-clip 4-packhttps://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand MicroscopeAmScopeAMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 BevelerSutter InstrumentsBV-10
Diamond abrasive plate Sutter Instruments104FDiamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-NClippard Instrument Laboratory, Inc.11761-2-pkgUsed to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose ClampClippard Instrument Laboratory, Inc.5000-2-pkg
Hose connectorClippard Instrument Laboratory, Inc.CT4-pkgNeed 5 hose connectors
Microinjection Needle HolderWorld Precision InstrumentsMPH3-10Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000Sutter InstrumentsAny needle puller
Photo-Flo 200 SolutionB&H Photo, Video and AudioBH #KOPF200P  MFR #1464510wetting agent
Pressure GaugeClippard Instrument Laboratory, Inc.PG-1000-100 psi gauge
Reference wickSutter InstrumentsX050300
Reference wick holderSutter InstrumentsM100019
RegulatorClippard Instrument Laboratory, Inc.01-MarNeed #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 inDancoModel # 59849
T fittingClippard Instrument Laboratory, Inc.15002-2-pkg
Threaded BarEither a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubingClippard Instrument Laboratory, Inc.URH1-0804-BLT-050

References

  1. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  2. O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. Transformation systems in insects. Meth....

Explore More Articles

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved