שיקוע רטוב של מחטי מיקרו-הזרקה תוך ניצול לחץ אוויר קבוע למשוב על פתיחת המחט

Summary

פרוטוקול זה מתאר הרכבה של מערכת פנאומטית להעברת אוויר בלחץ למחט במהלך תהליך שיקוע המחט. הפרוטוקול מתאר גם את תהליך השיקוע ליצירת מחטי מיקרו-הזרקה חדות וכיצד לאמוד את גודל הפתיחה היחסי של המחט.

Abstract

מחטי מיקרו-הזרקה הן כלי קריטי בהעברת ריאגנטים לשינוי גנום, רכיבי CRISPR (רנ"א מנחה, חלבון Cas9 ותבנית תורם), ורכיבי מערכת טרנספוזון (פלסמידים וטרנספוזאז mRNA) לעוברי חרקים מתפתחים. מחטי מיקרו-הזרקה חדות חשובות במיוחד במהלך הלידה של חומרים משנים אלה מכיוון שהן מסייעות למזער את הנזק לעובר המוזרק, ובכך להגדיל את הישרדותם של עוברים אלה בהשוואה להזרקה עם מחטים שאינן משופעות. יתר על כן, שיקוע המחטים מייצר מחטים עקביות יותר ממחט למחט בהשוואה למחטים הנפתחות על ידי שבירה אקראית של קצה המחט על ידי הברשה של קצה המחט כנגד חפץ (צד של כיסוי, פני השטח של העובר שיש להזריק וכו '). תהליך השיקוע הרטוב של מחטי מיקרו-הזרקה עם אוויר בלחץ קבוע המועבר למחט מאפשר לאדם המשופע את המחט לדעת מתי המחט פתוחה (נוכחות של בועות) וגם נותן אינדיקציה יחסית לגודל פתח המחט שנוצר. ניתן לקבוע את גודל הפתח היחסי במחט על ידי התאמת לחץ האוויר המועבר למחט עד להשגת שיווי משקל ובועות מפסיקות לזרום מקצה המחט. ככל שהלחץ שבו מגיעים לשיווי המשקל נמוך יותר, כך גודל המחט גדול יותר; ולהפך, ככל שהלחץ גבוה יותר, כך גודל המחט קטן יותר.

Introduction

שינוי גנטי של חרקים הוא תהליך שפותח במקור בדרוזופילה על ידי רובין וספרדלינג, ובמהלך השנים תהליך זה שונה ליצירת שינויים גנטיים במינים אחרים¹. התהליך מסתמך על מסירה מדויקת של רכיבי שינוי המוזרקים במיקרו לעוברים בחלון זמן ומיקום מסוים בתוך העובר ^{המתפתח 2,3,4}. מחטי מיקרו-הזרקה חדות הן כלי קריטי בתהליך השינוי הגנטי של חרקים מסוימים, כגון יתושים 4,5,6,7,8,9 וזבובי חול¹⁰, בעוד שהן פחות קריטיות עבור חרקים אחרים, כגון תולעי ....

Protocol

הערה: הפרוטוקול כמתואר להלן משתמש במיקרו-נימי Sutter BV-10 משופע. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות שונה לשימוש עם כל מודל microcapillary משופע.

1. הרכבה של ווסת, מד לחץ וצינורות אספקת אוויר

1. חותכים קטע של צינורות אורתן לחיבור מאספקת האוויר לבסיס הרגולטור (R; ס?.......

Discussion

שינוי גנטי של יתושים מסתמך על מיקרו-הזרקה מדויקת של חומרי השינוי (פלסמידים, רנ"א מנחה או חלבונים) לעוברים קדם-בלסטודרם 3,4,5,6,7,8. קריטיות לתהליך זה הן מחטים חדות המנק.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050