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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve a montagem de um sistema pneumático para o fornecimento de ar pressurizado a uma agulha durante o processo de biselamento da agulha. O protocolo descreve ainda o processo de chanfro para criar agulhas de microinjeção afiadas e como medir o tamanho relativo da abertura da agulha.

Abstract

As agulhas de microinjeção são uma ferramenta crítica na entrega de reagentes de modificação do genoma, componentes CRISPR (RNAs guia, proteína Cas9 e modelo de doador) e componentes do sistema de transposons (plasmídeos e mRNA de transposase) em embriões de insetos em desenvolvimento. Agulhas afiadas de microinjeção são particularmente importantes durante a administração desses agentes modificadores, pois ajudam a minimizar os danos ao embrião que está sendo injetado, aumentando assim a sobrevivência desses embriões em comparação com a injeção com agulhas não chanfradas. Além disso, o chanfro de agulhas produz agulhas que são mais consistentes de agulha para agulha em comparação com agulhas abertas quebrando aleatoriamente a ponta da agulha escovando a ponta contra um objeto (lado de uma lamínula, a superfície do embrião a ser injetado, etc.). O processo de chanfro úmido de agulhas de microinjeção com ar de pressão constante entregue à agulha permite que a pessoa que chanfra a agulha saiba quando a agulha está aberta (presença de bolhas) e também dá uma indicação relativa de quão grande foi a abertura da agulha. O tamanho relativo da abertura na agulha pode ser determinado ajustando a pressão do ar fornecida à agulha até que um equilíbrio seja alcançado e as bolhas parem de fluir da ponta da agulha. Quanto menor a pressão na qual o equilíbrio é alcançado, maior o tamanho da agulha; e, inversamente, quanto maior a pressão, menor o tamanho da agulha.

Introduction

A modificação genética de insetos é um processo originalmente desenvolvido em Drosophila por Rubin e Spradling e, ao longo dos anos, esse processo foi modificado para criar modificações genéticas em outras espécies1. O processo depende da entrega precisa de componentes de modificação microinjetados em embriões em uma janela específica de tempo e local dentro do embrião em desenvolvimento 2,3,4. Agulhas afiadas de microinjeção são uma ferramenta crítica no processo de modificação genética de alguns insetos, como mosquit....

Protocol

NOTA: O protocolo descrito abaixo usa o microcapilar chanfrado Sutter BV-10. No entanto, este protocolo pode ser modificado para uso com qualquer modelo de chanfro microcapilar.

1. Montagem do regulador, manômetro e tubulação de suprimento de ar

  1. Corte uma seção da tubulação de uretano para a conexão do suprimento de ar à base do regulador (R; Seção 1, Figura 1). O comprimento desta seção dep.......

Representative Results

O procedimento descrito acima produz agulhas de microinjeção consistentemente afiadas. Agulhas afiadas são caracterizadas por serem capazes de se inserir em embriões de insetos coriões moles, como embriões de mosquitos, com pouca ou nenhuma resistência da membrana embrionária. Quando os embriões de mosquito são microinjetados para modificação genética, a membrana do embrião é relativamente elástica. Empurrar uma agulha cega contra a membrana do embrião fará com que ela .......

Discussion

A modificação genética de mosquitos depende da microinjeção precisa dos materiais de modificação (plasmídeos, RNAs guia ou proteínas) em embriões pré-blastoderma 3,4,5,6,7,8. Cruciais para esse processo são agulhas afiadas que perfuram facilmente o embrião durante a injeção

Acknowledgements

O autor gostaria de agradecer as seguintes pessoas. A equipe da Instalação de Transformação de Insetos da Universidade de Maryland: Channa Aluvihare, Robert Alford e Daniel Gay. Sem seu trabalho dedicado, a Instalação de Transformação de Insetos não existiria. Vanessa Meldener-Harrell pela revisão deste manuscrito.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.0 mm O.D. microcapillariesWorld Precision Instruments
Beveler pedestal oilSutter Instruments008
Bicycle fender clipVeloOrangeR-clip 4-packhttps://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand MicroscopeAmScopeAMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 BevelerSutter InstrumentsBV-10
Diamond abrasive plate Sutter Instruments104FDiamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-NClippard Instrument Laboratory, Inc.11761-2-pkgUsed to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose ClampClippard Instrument Laboratory, Inc.5000-2-pkg
Hose connectorClippard Instrument Laboratory, Inc.CT4-pkgNeed 5 hose connectors
Microinjection Needle HolderWorld Precision InstrumentsMPH3-10Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000Sutter InstrumentsAny needle puller
Photo-Flo 200 SolutionB&H Photo, Video and AudioBH #KOPF200P  MFR #1464510wetting agent
Pressure GaugeClippard Instrument Laboratory, Inc.PG-1000-100 psi gauge
Reference wickSutter InstrumentsX050300
Reference wick holderSutter InstrumentsM100019
RegulatorClippard Instrument Laboratory, Inc.01-MarNeed #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 inDancoModel # 59849
T fittingClippard Instrument Laboratory, Inc.15002-2-pkg
Threaded BarEither a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubingClippard Instrument Laboratory, Inc.URH1-0804-BLT-050

References

  1. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  2. O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. Transformation systems in insects. Meth....

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