Chanfro úmido de agulhas de microinjeção utilizando pressão de ar constante para feedback sobre a abertura da agulha

Summary

Este protocolo descreve a montagem de um sistema pneumático para o fornecimento de ar pressurizado a uma agulha durante o processo de biselamento da agulha. O protocolo descreve ainda o processo de chanfro para criar agulhas de microinjeção afiadas e como medir o tamanho relativo da abertura da agulha.

Abstract

As agulhas de microinjeção são uma ferramenta crítica na entrega de reagentes de modificação do genoma, componentes CRISPR (RNAs guia, proteína Cas9 e modelo de doador) e componentes do sistema de transposons (plasmídeos e mRNA de transposase) em embriões de insetos em desenvolvimento. Agulhas afiadas de microinjeção são particularmente importantes durante a administração desses agentes modificadores, pois ajudam a minimizar os danos ao embrião que está sendo injetado, aumentando assim a sobrevivência desses embriões em comparação com a injeção com agulhas não chanfradas. Além disso, o chanfro de agulhas produz agulhas que são mais consistentes de agulha para agulha em comparação com agulhas abertas quebrando aleatoriamente a ponta da agulha escovando a ponta contra um objeto (lado de uma lamínula, a superfície do embrião a ser injetado, etc.). O processo de chanfro úmido de agulhas de microinjeção com ar de pressão constante entregue à agulha permite que a pessoa que chanfra a agulha saiba quando a agulha está aberta (presença de bolhas) e também dá uma indicação relativa de quão grande foi a abertura da agulha. O tamanho relativo da abertura na agulha pode ser determinado ajustando a pressão do ar fornecida à agulha até que um equilíbrio seja alcançado e as bolhas parem de fluir da ponta da agulha. Quanto menor a pressão na qual o equilíbrio é alcançado, maior o tamanho da agulha; e, inversamente, quanto maior a pressão, menor o tamanho da agulha.

Introduction

A modificação genética de insetos é um processo originalmente desenvolvido em Drosophila por Rubin e Spradling e, ao longo dos anos, esse processo foi modificado para criar modificações genéticas em outras espécies¹. O processo depende da entrega precisa de componentes de modificação microinjetados em embriões em uma janela específica de tempo e local dentro do embrião em desenvolvimento ^2,3,4. Agulhas afiadas de microinjeção são uma ferramenta crítica no processo de modificação genética de alguns insetos, como mosquit....

Protocol

NOTA: O protocolo descrito abaixo usa o microcapilar chanfrado Sutter BV-10. No entanto, este protocolo pode ser modificado para uso com qualquer modelo de chanfro microcapilar.

1. Montagem do regulador, manômetro e tubulação de suprimento de ar

1. Corte uma seção da tubulação de uretano para a conexão do suprimento de ar à base do regulador (R; Seção 1, Figura 1). O comprimento desta seção dep.......

Discussion

A modificação genética de mosquitos depende da microinjeção precisa dos materiais de modificação (plasmídeos, RNAs guia ou proteínas) em embriões pré-blastoderma 3,4,5,6,7,8. Cruciais para esse processo são agulhas afiadas que perfuram facilmente o embrião durante a injeção

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050