Мокрое снятие фаски с игл для микроинъекций с использованием постоянного давления воздуха для обратной связи при открытии иглы

Summary

В этом протоколе описывается сборка пневматической системы для подачи сжатого воздуха к игле в процессе снятия фаски с иглы. В протоколе также описывается процесс снятия фаски для создания острых игл для микроинъекций и то, как измерить относительный размер отверстия иглы.

Abstract

Иглы для микроинъекций являются важнейшим инструментом для доставки реагентов для модификации генома, компонентов CRISPR (направляющих РНК, белка Cas9 и донорской матрицы) и компонентов системы транспозонов (плазмид и мРНК транспозазы) в развивающиеся эмбрионы насекомых. Острые иглы для микроинъекций особенно важны во время доставки этих модифицирующих агентов, поскольку они помогают свести к минимуму повреждение инъецируемого эмбриона, тем самым увеличивая выживаемость этих эмбрионов по сравнению с инъекциями иглами без скоса. Кроме того, при снятии фаски иглы получаются иглы, которые более однородны от иглы к игле по сравнению с иглами, вскрытыми путем случайного ломания кончика иглы путем прикосновения кончика к объекту (стороне покровного стекла, поверхности эмбриона, который будет введен и т. д.). Процесс влажного снятия фаски с игл для микроинъекций с подачей воздуха к игле под постоянным давлением позволяет человеку, снимающему фаску с иглы, знать, когда игла открыта (наличие пузырьков), а также дает относительное представление о том, насколько большое отверстие иглы было создано. Относительный размер отверстия в игле можно определить, регулируя давление воздуха, подаваемого на иглу, до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие и пузырьки не перестанут вытекать из кончика иглы. Чем ниже давление, при котором достигается равновесие, тем больше размер иглы; И наоборот, чем выше давление, тем меньше размер иглы.

Introduction

Генетическая модификация насекомых — это процесс, первоначально разработанный у дрозофил Рубином и Спрэдлингом, и с годами этот процесс был модифицирован для создания генетических модификаций у^{других видов.} Процесс основан на точной доставке компонентов модификации, микроинъецированных в эмбрионы в определенный промежуток времени и в определенном месте внутри развивающегося эмбриона ^2,3,4. Острые иглы для микроинъекций являются критически важным инструментом в процессе генетической модификации некоторых насекомых, таки....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе, описанном ниже, используется микрокапиллярный скошенный Sutter BV-10. Тем не менее, этот протокол может быть модифицирован для использования с любой моделью с микрокапиллярной скошенностью.

1. Сборка регулятора, манометра и трубк?.......

Discussion

Генетическая модификация комаров основана на точном микроинъекционном вводе модифицирующих материалов (плазмид, направляющих РНК или белков) в эмбрионы, предшествующие бластодерме 3,4,5,6,7,8.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050