通过磁激活细胞分选从新鲜灌注的成年小鼠脑中分离下丘脑小胶质细胞

Summary

我们描述了一种使用磁激活细胞分选 （MACS） 在相对较短的时间内从小鼠下丘脑（或等效的小脑结构）中分离小胶质细胞的方案。MACS 分选的下丘脑小胶质细胞可用于 离体 分析，并可以接种以进行 体外 测定。

Abstract

小胶质细胞作为大脑的常驻巨噬细胞，对于维持大脑稳态至关重要。它们在发育过程中塑造神经元回路，调查环境中的碎片或死细胞，以及对大脑中的感染和损伤做出反应，以及许多其他功能。然而，它们在神经发育和突触可塑性和病理生理学中的重要作用尚未完全定义，这突出了进一步研究的必要性。为了更全面地了解小胶质细胞在这些过程中的作用，我们需要分离小胶质细胞并从遗传、代谢和功能上表征它们。然而，从成年小鼠中分离小胶质细胞，尤其是从小脑结构中分离小胶质细胞是具有挑战性的，因为它们只占总脑细胞的一小部分，而且分离的小胶质细胞的产量通常太低。在这里，使用 CD11b ⁺ 微珠对小胶质细胞进行磁性分离使我们能够从新鲜灌注的成年小鼠大脑的下丘脑中分选小胶质细胞。目前的方法使我们能够在短时间内获得相对较高的纯度和产量，同时保持细胞活力。

Introduction

小胶质细胞相当于总神经细胞的 5-20%，是唯一起源于卵黄囊中红髓样祖细胞并在胚胎第 E9.5 天左右开始在发育中的大脑中定植的神经胶质细胞 ^1,2。它们是长寿细胞，能够独立于骨髓来源的细胞缓慢地进行自我更新³。作为一些最具活力的细胞，它们能够响应环境和环境线索获得不同的表型 ^2,4。在能够调节其活动的信号中，中枢神经系统 （CNS） 损伤、神经元活动以及营养物质最有效。越来越多的研究表明，小胶质细胞在损伤、神经退行性疾病和肥胖中起着关键作用 ^2,5,6。然而，小胶质细胞在生理过程和病理生理学中的确切作用需要进一步研究。因此，它们在不同条件下的转录、代谢和功能表征非常重要，需要分离它们，因为原位研究适用于 DNA、RNA 和蛋白质的定位和定性比较，以及小胶质细胞的形态学表征。

小胶质细胞分离的技术多种多样，其中包括 Percoll 梯度法⁷、流式细....

Protocol

所描述的所有动物实验均严格按照欧盟建议 （2013/63/EU） 进行，并获得了波尔多大学当地伦理委员会 （CEEA50） 和法国高等教育、研究和创新部的批准（已批准项目 NTS-FR-619193 v.1 的非技术摘要，2022 年 12 月 23 日）。

以下方案在平均年龄为 2-4 个月的成年 C57BL/6 小鼠上进行。然而，考虑到 CNS 的免疫细胞景观可能会改变并且常驻巨噬细胞和单核细胞的百分比可能会增加（例如，.......

Discussion

目前的方案提出了通过磁激活细胞分选从新鲜灌注的成年小鼠脑中分离下丘脑小胶质细胞。上述结果证实了分离细胞的纯度和活力，以及该方法在 体外功能表征小胶质细胞的有效性，例如通过吞噬活性和 ROS 生产定量。分离特定细胞群的经典方法也可用于小胶质细胞。密度梯度分级法是一种众所周知的方法，用于根据细胞的大小和/或密度分离不同的细胞及其颗粒。该技术可应用于原代小胶.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130-107-677	The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A).
Albumin Bovine FrV BSA	EuroMedex	04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse - small size	Miltenyi	130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10492
Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL	CellTreat	978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate	Gibco	14287-072
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi	130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	Thermofisher	78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x)	Thermofisher	78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Thermofisher	14065056
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red	Sigma-Aldrich	L3280
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001	This reagent was used to perform PCR.
MACS SmartStrainers (70 µm)	Miltenyi	130-110-916
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermofisher	23235
M-PER Mammalian Extraction Buffer	Thermofisher	78503
MS Columns	Miltenyi	130-042-201	Referred as small columns in the protocol.
MultiMACS Cell24 Separator Plus	Miltenyi	130-098-637
PBSS, pH 7.4	Thermofisher	10010023
qScript XLT cDNA SuperMix	Quanta biosciences	733-1177	The kit was used to syntesize cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6011	The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA.
Vacutainer safety-lok 21 G	Becton Dickinson	367282